نوسان ساز مصنوعی سریع ، قوی و قابل تنظیم

1 گروه مهندسی زیستی ، دانشگاه کالیفرنیا ، سن دیگو ، لا جولا ، کالیفرنیا ، ایالات متحده.

اسکات کوکسون

1 گروه مهندسی زیستی ، دانشگاه کالیفرنیا ، سن دیگو ، لا جولا ، کالیفرنیا ، ایالات متحده.

متیو آر. بنت

1 گروه مهندسی زیستی ، دانشگاه کالیفرنیا ، سن دیگو ، لا جولا ، کالیفرنیا ، ایالات متحده.

2 موسسه علوم غیرخطی ، دانشگاه کالیفرنیا ، سن دیگو ، لا جولا ، کالیفرنیا ، ایالات متحده.

ویلیام اچ.

1 گروه مهندسی زیستی ، دانشگاه کالیفرنیا ، سن دیگو ، لا جولا ، کالیفرنیا ، ایالات متحده.

Lev S. Tsimring

2 موسسه علوم غیرخطی ، دانشگاه کالیفرنیا ، سن دیگو ، لا جولا ، کالیفرنیا ، ایالات متحده.

جف عجله

1 گروه مهندسی زیستی ، دانشگاه کالیفرنیا ، سن دیگو ، لا جولا ، کالیفرنیا ، ایالات متحده.

2 موسسه علوم غیرخطی ، دانشگاه کالیفرنیا ، سن دیگو ، لا جولا ، کالیفرنیا ، ایالات متحده.

J. S. ، S. C. و M. R. B. به طور مساوی در این کار نقش داشته است. j. s. و J. H. مدارهای نوسان ساز و J. S. مدارها را ساخت. S. C. آزمایش های میکروسکوپ ، و J. S. و S. C آزمایشات فلوسیتومتری جریان را انجام داد. S. C. ، L. S. T. و J. H. تجزیه و تحلیل داده های تک سلولی را انجام داد. M. R. B. ، W. H. M. و L. S. T. مدل سازی محاسباتی را انجام داد. همه نویسندگان نسخه خطی را نوشتند.

3 نویسنده مسئول. گروه مهندسی زیستی ، دانشگاه کالیفرنیا ، سن دیگو ، MailCode 0412 ، La Jolla ، CA 92093-0412 ، ایالات متحده. تلفن: 858 822 3442. نمابر: 858 534 5722. ude. dscu. gneoib@ytsah

کاربران ممکن است محتوا را در چنین اسنادی ، چاپ ، کپی و بارگیری متن و داده را مشاهده ، چاپ ، کپی و بارگیری کنند ، موضوع همیشه به شرایط کامل استفاده: http: //www. nature.com/authors/editorial_policies/license.html#terms

داده های مرتبط

خلاصه

یکی از هدف های تعیین کننده زیست شناسی مصنوعی ، توسعه رویکردهای مبتنی بر مهندسی است که امکان ساخت شبکه های تنظیم کننده ژن را با توجه به "مشخصات طراحی" تولید شده از مدل سازی محاسباتی 1-6 فراهم می کند. این رویکرد یک چارچوب سیستماتیک برای بررسی چگونگی ایجاد یک شبکه نظارتی خاص یک رفتار فنوتیپی خاص را فراهم می کند. چندین مدارهای اساسی ژن با استفاده از این رویکرد ، از جمله سوئیچ های ضامن 7 و نوسانگر 8-10 توسعه یافته است ، و اینها در زمینه های جدید مانند توسعه بیوفیلم تحریک شده 11 و کنترل جمعیت سلولی 12 استفاده شده است. در اینجا ما یک نوسان ساز ژنتیکی مهندسی شده در اشریشیا کولی را توصیف می کنیم که سریع ، قوی و پایدار است و دوره های نوسان قابل تنظیم به سرعت 13 دقیقه است. نوسان ساز با استفاده از یک معماری شبکه قبلاً مدل شده شامل حلقه های بازخورد مثبت و منفی مرتبط با 113 طراحی شده است. با استفاده از یک بستر میکروسیالی متناسب با میکروسکوپ تک سلولی ، ما دقیقاً شرایط محیطی را کنترل می کنیم و نوسانات را در سلولهای فردی از طریق چندین چرخه کنترل می کنیم. آزمایشات استحکام و تداوم چشمگیر نوسانات در مدار طراحی شده را نشان می دهد. تقریباً در هر سلول نوسانات فلورسانس با دامنه بزرگ در طول مشاهده به نمایش گذاشته شده است. دوره نوسان را می توان با تغییر سطح القا کننده ، دما و منبع رسانه تنظیم کرد. مدل سازی محاسباتی نشان می دهد که اصل طراحی کلیدی برای ساخت یک نوسان ساز قوی ، تأخیر زمانی در حلقه بازخورد منفی است ، که می تواند از نظر مکانیکی از آبشار فرآیندهای سلولی درگیر در تشکیل یک فاکتور رونویسی عملکردی ناشی شود. حلقه بازخورد مثبت باعث افزایش استحکام نوسانات می شود و امکان تنظیم بیشتر را فراهم می کند. بررسی مدل تصفیه شده ما وجود یک طرح نوسان ساز ساده را بدون بازخورد مثبت نشان می دهد ، و ما یک فشار نوسان ساز را تأیید می کنیم که این پیش بینی محاسباتی را تأیید می کند.

نوسان ساز ژن مصنوعی بر اساس یک طرح نظری قبلاً گزارش شده 1 است و با استفاده از اجزای اشرشیاکلی ساخته شده است (شکل 1A). مروج هیبریدی (P_lac/ara-114) از سایت اپراتور فعال سازی از پروموتر Arabad که در مکان عادی خود نسبت به سایت شروع رونویسی قرار گرفته است تشکیل شده است ، و سایت های اپراتور سرکوب از پروموتور Laczya هم در بالادست و هم در پایین دست از سایت شروع رونویسی قرار گرفته است. در صورت عدم وجود IPTG توسط پروتئین ARAC در حضور آرابینوز فعال شده و توسط پروتئین LACI سرکوب می شود. ما ژنهای ARAC ، LACI و YEMGFP را تحت کنترل سه نسخه یکسان P قرار دادیم_lac/ara-1برای تشکیل سه ماژول رونویسی هسته ای (اطلاعات تکمیلی). از این رو ، فعال سازی پروموتورها با افزودن Arabinose و IPTG به رسانه منجر به رونویسی از هر مؤلفه مدار و افزایش تولید ARAC در حضور آربینوز منجر به یک حلقه بازخورد مثبت می شود که باعث افزایش فعالیت پروموتر می شود. با این حال ، افزایش همزمان تولید LACI منجر به یک حلقه بازخورد منفی مرتبط می شود که باعث کاهش فعالیت پروموتر می شود ، و فعالیت دیفرانسیل دو حلقه بازخورد می تواند رفتار نوسان را 113 انجام دهد.

نوسانات در مدار فیدبندی دوگانه. A ، نمودار شبکه نوسان ساز دوتایی. یک مروج ترکیبی P_lac/ara-1رونویسی از ARAC و LACI را ایجاد می کند و حلقه های بازخورد مثبت و منفی را تشکیل می دهد. B ، مسیرهای فلورسانس تک سلولی ناشی از 0. 7 ٪ Arabinose و 2 میلی متر IPTG. نقاط نشان دهنده مقادیر فلورسانس تجربی ، و منحنی های جامد توسط یک فیلتر Savitsky-Golay صاف می شوند (برای مسیرهای بدون سیم ، به شکل 3 مراجعه کنید). مسیر به رنگ قرمز با نقشه چگالی بالا مطابقت دارد. مسیرهای چگالی C-H ، تک سلولی برای شرایط مختلف IPTG (C ، 0 میلی متر IPTG ؛ D ، 0. 25 میلی متر ؛ E ، 0. 5 میلی متر ؛ F ، 1 میلی متر ؛ G ، 2 میلی متر ؛ H ، 5 میلی متر). محورهای X در حداقل هستند.

سلولهای نوسان ساز (با مشخصات JS011) نوسانات فلورسانس همه جا را در کل زمان اجرا هر آزمایش (حداقل چهار ساعت) به نمایش گذاشتند. به عنوان مثال ، در 0. 7 ٪ Arabinose و 2 میلی متر IPTG ، بیش از 99 ٪ سلولها نوسانات را با دوره تقریبی 40 دقیقه نشان دادند (شکل 1b ، ، g) گرم) جدول تکمیلی 1 و فیلم تکمیلی 1). ماهیت بسیار پویا اجزای نوسان ساز با پوسیدگی سریع سیگنال GFP نشان داده شده است ، که در کمتر از 10 دقیقه از اوج به فرورفتگی می رود (شکل 1B). مرحله نوسان بین سلولهای دختر ارثی بود ، که منجر به نوسانات هماهنگ در مناطقی از میکروکلونی حاصل از یک سلول مشترک شد. این همگام سازی محدود به چند دوره بود ، احتمالاً به دلیل انتشار فاز نوسان. ما از یک دستگاه میکروسیالی با سوئیچ مرز لمینار در بالادست محفظه رشد استفاده کردیم تا در مورد شروع نوسانات هماهنگ بررسی شود (شکل مکمل. 2 C-D). سلولهای رشد یافته در صورت عدم وجود القا کننده نوسانات آغاز شده به صورت همزمان با افزودن القا کننده (فیلم تکمیلی 10) ، که احتمال استفاده از فلوسیتومتری جریان را برای توصیف بیشتر نوسان ساز نشان می دهد. فلوسیتومتری جریان نمونه ها به طور مداوم از یک فرهنگ در رشد لگاریتمی که با 0. 7 ٪ آرابینوز القا شده و 2 میلی متر IPTG در میانگین فلورسانس سلولی نشان داده شده است (شکل 8). القاء نوسان بسیار سریع (کمتر از 5 دقیقه) و در ابتدا هماهنگ هماهنگ بود. دامنه این نوسانات فله با پیشرفت این آزمایش پوسیده شده است ، همانطور که از ضعف سلولهای فردی در کلونی (اطلاعات تکمیلی) انتظار می رود. با این حال ، دوره به دست آمده از روش فلوسیتومتری جریان (نقاط داده های سبز در همه شکل) مطلوب با آن به دست آمده از سلولهای منفرد با استفاده از میکروسکوپ (نقاط داده قرمز در همه شکل) مقایسه شد.

نوسان ساز در محدوده وسیعی از شرایط القاء کننده و دما بسیار قوی بود. در 0. 7٪ آرابینوز و 37 درجه سانتی گراد، تقریباً هر سلول مشاهده شده در تمام غلظت های IPTG مورد بررسی قرار گرفت (شکل های 1b - h و فیلم های تکمیلی 1-8). تغییر غلظت IPTG اجازه تنظیم دوره نوسان ساز را می دهد (شکل 2a)، به ویژه در غلظت های پایین IPTG. این دوره در غلظت های بالای IPTG کاهش یافت، و شناسایی بعدی پروموتر نشان داد که این رفتار غیر یکنواخت احتمالاً ناشی از تداخل IPTG با فعال سازی AraC 15 است (اطلاعات تکمیلی). زمان دوبرابر شدن سلول در دستگاه میکروسیال تا حد زیادی بین آزمایش ها ثابت باقی ماند، از 22. 3 تا 27. 6 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی گراد، و همبستگی کمی با غلظت IPTG نشان داد (R2 = 0. 132). مسیرهای فلورسانس سلولی منفرد افزایش تدریجی در دوره نوسانی را نشان می دهند که سلول ها روی دستگاه میکروسیال تصویربرداری می شوند (شکل تکمیلی 4). این افزایش در زمان های دو برابری مشاهده نشد، به این معنی که سلول ها مشکلات تغذیه ای یا استرس محیطی را تجربه نمی کنند که ممکن است باعث تغییر در رفتار نوسان گر شود.

نوسانات قویa-c، دوره های نوسانی در ترانسکت ها در امتداد 0. 7٪ آرابینوز (a)، 2 میلی مولار IPTG (b)، یا هر دو با دمای متغیر (c). دوره های متوسط از میکروسکوپ تک سلولی (الماس قرمز ± s. d.) یا فلوسیتومتری (دایره های سبز) نشان داده شده است. منحنی های سیاه خطوط روند یا در c، پیش بینی نظری بر اساس مقادیر مرجع در 30 درجه سانتیگراد هستند (به اطلاعات تکمیلی مراجعه کنید). نمونه ها در LB یا محیط حداقل (×) رشد می کنند. d، دوره نوسانی و زمان تقسیم سلولی با کاهش دمای رشد به طور یکنواخت افزایش می یابد. نمادها مانند بالا هستند و خط سیاه یک رگرسیون خطی از نمونه های رشد یافته در LB است.

به منظور بررسی بیشتر استحکام نوسان ساز ، ما در مورد تأثیر متفاوت Arabinose ، دما و منبع رسانه بررسی کردیم. با مقدار ثابت 2 میلی متر IPTG و در دمای 37 درجه سانتیگراد ، دوره نوسان را می توان با تغییر سطح آرابینوز از 0. 1-3. 0 ٪ از 13-58 دقیقه تنظیم کرد (شکل 2B). سلولهای رشد یافته در غیاب آرابینوز سطح قابل اندازه گیری GFP را در میکروسکوپ تک سلولی یا آزمایش های فلوسیتومتری جریان بیان نمی کنند ، و به نظر می رسد سطح بالای آرابینوز سیستم را اشباع می کند. ما نوسانات پایدار را در طیف وسیعی از دما از 25-37 درجه سانتیگراد مشاهده کردیم ، با یک دوره کاهش به عنوان تابعی از دما (شکل 2C). همانطور که انتظار می رود ، زمان دو برابر شدن سلول نیز با دما کاهش می یابد و دوره نوسان با زمان دو برابر شدن سلول به صورت یکنواخت افزایش می یابد (شکل 2D). نوسان ساز همچنین در حداقل یک محیط با 2 گرم در لیتر گلوکز عمل می کند (شکل 2C - D). اگرچه زمان دو برابر شدن سلول در محیط حداقل به طور قابل توجهی طولانی تر از LB بود (80-90 دقیقه در مقابل 22-24 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد) ، دوره در حداقل محیط بسیار شبیه به LB بود (شکل 2C - D). این نتیجه ، همراه با وابستگی شدید دوره به غلظت IPTG و Arabinose (در زمان دو برابر شدن سلولی) ، نشان می دهد که نوسان ساز مصنوعی به شدت با چرخه سلولی همراه نیست. به نظر می رسد وابستگی مشابه دوره و زمان دو برابر شدن به دما به دلیل تغییر ترمودینامیکی ثابتهای نرخ مؤثر بر تمام فرآیندهای سلولی است.

نوسان ساز طبق اصول طراحی تعیین شده از کار نظری قبلی 1 ساخته شده است. با این حال ، ما دریافتیم که این مدل اصلی نتوانسته است دو جنبه مهم آزمایشات را توصیف کند. اول ، این مدل نمی تواند وابستگی عملکردی مشاهده شده از دوره به سطح القا کننده را توصیف کند. دوم ، و شاید مهمتر از همه ، از آنجا که تنظیم دقیق پارامتر برای نوسانات در مدل اصلی ضروری بود ، قادر به توصیف رفتار قوی نشان داده شده در آزمایشات نبود. این نشان می دهد که فقط یک منطقه کوچک از فضای القا کننده باید بر خلاف رفتار قوی که در آزمایشات نشان داده شده است ، از نوسانات پشتیبانی کند. این کاستی ها مجبور به ارزیابی مجدد از مشتق معادلات نوسان ساز شد و منجر به یک مدل محاسباتی جدید شد که با دقت بیشتری مشاهدات تجربی را توصیف کرد. مدل جدید شامل همان معماری بازخورد مثبت و منفی است ، اما شامل جزئیاتی است که از مدل قبلی حذف شده است. به طور خاص ، ما دریافتیم که فرآیندهای مدل سازی به طور مستقیم مانند اتصال پروتئین DNA ، مولتی متری ، ترجمه ، حلقه DNA ، تخریب آنزیمی و تاشو پروتئین تا حد زیادی دقت مدل را افزایش می دهد. نتیجه یک مدل محاسباتی است که نسبت به تغییرات پارامتر بسیار قوی است و پویایی نوسان ساز را برای طیف گسترده ای از غلظت IPTG و Arabinose به درستی توصیف می کند (به جعبه مدل و اطلاعات تکمیلی مراجعه کنید).

در بررسی مدل تصفیه شده ما ، منطقه دیگری را در فضای پارامتر کشف کردیم که از رفتار نوسان پشتیبانی می کند. مدل ما پیش بینی کرد که یک سیستم مداوم فعال با سرکوب کنترل شده توسط یک حلقه بازخورد منفی می تواند در صورت عدم بازخورد مثبت نوسانات ایجاد کند (شکل مکمل 19). پیشنهاد شده است که شبکه های ژن بازخورد منفی می توانند نوسان داشته باشند به شرط اینکه تأخیر در بازخورد 16،17 وجود داشته باشد ، و در حالی که تأخیر صریح در مدل ما وجود ندارد ، مراحل میانی ترجمه ، تاشو پروتئین و چند منظوره LACI یک شکل مؤثر را ارائه می دهداز تأخیر 18 که برای حمایت از نوسانات کافی است. ما این سیستم را در E. coli با استفاده از یک پروموتور که در غیاب LACI (یا حضور IPTG) فعال می شود ، برای هدایت بیان LACI و GFP ایجاد کردیم (شکل 3A). ما نوسانات در این سلول ها را مشاهده کردیم که توسط میکروسکوپ تک سلولی تحت شرایط القاء مورد بررسی قرار می گیرد (شکل 3B ، شکل 5 و فیلم تکمیلی 11). این نوسانات به اندازه نوسان ساز دوتایی دوگانه مجزا یا منظم نبودند و همیشه به حالت کم نور برنگشتند ، مطابق با پیش بینی های مدل محاسباتی. علاوه بر این ، این دوره تا حد زیادی تحت تأثیر غلظت IPTG (متفاوت از 5 ٪ در طول سه دوره آزمایشی از 0. 6-20 میلی متر IPTG) بی تأثیر نبود ، نشان می دهد که افزودن حلقه بازخورد مثبت نقش دوگانه ای در تنظیم نوسانات منظم و اجازه تنظیم دوره دوره را فراهم می کند(به اطلاعات تکمیلی مراجعه کنید).

نوسان ساز بدون حلقه بازخورد مثبت. A ، نمودار شبکه نوسان ساز بازخورد منفی. این نوسان ساز شبیه به نوسان ساز دوتایی است به جز اینکه P_llaco-1مروج رانندگی مؤلفه ها در صورت عدم وجود LACI یا در حضور IPTG بدون نیاز به فعال کننده بیان می کند. B ، مسیرهای چگالی تک سلولی برای سلولهای حاوی این نوسان ساز (به فیلم تکمیلی 11 و شکل مکمل 5 مراجعه کنید).

در زمینه زیست شناسی مصنوعی ، یافته های ما نشان می دهد که باید هنگام تهیه فرضیات ساده در طراحی مدارهای ژن مهندسی شده ، احتیاط کرد. ما دریافتیم که یک مدل کامل از سیستم که مراحل میانی مانند مولتی متری ، ترجمه ، تاشو پروتئین و حلقه DNA را در نظر می گیرد ، ضروری است. دلیل این امر نه تنها در مقیاس زمانی سیستم بلکه در زمان متوالی وقایع نیز نهفته است. از آنجا که مراحل میانی در تولید پروتئین عملکردی زمان می برد ، معرفی آنها در مدل شکل مهمی از تأخیر 18-20 ایجاد می کند. ما دریافتیم که این تأخیر مؤثر استحکام مدل ما را تا حد زیادی افزایش می دهد. به عنوان مثال ، فعالیت نوسان در مدل فقط نسبت به مقادیر انتخاب شده برای پارامترهای سیستم (اطلاعات تکمیلی) حساس است ، دلالت بر این دارد که تقریباً همه سلولها باید با وجود تغییرات تصادفی جزئی در پارامترهای ذاتی خود ، نوسان کنند (جدول تکمیلی). این تعیین معیارهای طراحی مدار ژن در زمینه فعلی یک نوسان ساز سریع ، قوی و قابل تنظیم مرحله ای را برای طراحی برنامه های کاربردی مانند طرح های بیان که قادر به دور زدن سازگاری سلولی هستند ، ساعتهای متمرکز که هماهنگ رفتار درون سلولی هستند ، تعیین می کند. سیستم عامل مهندسی 21 که پاسخ جهانی ژنوم را به یک آشفتگی نوسان اندازه گیری می کند.

جعبه مدل سازی

ما از تکنیک های استاندارد برای ساخت هر دو مدل محاسباتی تصادفی و قطعی 3،22-25 بر اساس همان واکنشهای بیوشیمیایی اساسی نشان داده شده در شکل 4A استفاده کردیم (برای جزئیات کامل مدل سازی به اطلاعات تکمیلی مراجعه کنید). در حالی که تعامل بین فاکتورهای رونویسی و DNA به طور کلی برای مدل سازی در جزئیات 26 کاملاً پیچیده است ، ما از منحنی های القایی تجربی برای کالیبراسیون سطح القایی در واکنشهای توصیف شده شبکه استفاده کردیم (شکل مکمل 10). در طول بسیاری از چرخه های نوسان ، شبیه سازی های قطعی پس از آن نشان داده شد که به طور دقیق تکامل زمانی نحوه توزیع های تولید شده توسط شبیه سازی های تصادفی دقیق 27 را نشان می دهد. سری زمانی نماینده برای غلظت پروتئین به دست آمده از مدلهای تصادفی و قطعی در شکل ها نشان داده شده است. 4B - ج. این مدل ها بسیار قوی هستند که رفتار نوسان برای طیف گسترده ای از مقادیر پارامتر و جزئیات شبکه (اطلاعات تکمیلی) وجود دارد. نکته مهم ، ما توافق کمی عالی با دوره به دست آمده تجربی به عنوان تابعی از سطح القا کننده پیدا کردیم (شکل 4D - E).

مدل سازی نوسان ساز ژنتیکی. A ، فرآیندهای میانی به صراحت در مدل نوسان ساز تصفیه شده مدل می شوند. B-C ، نتایج شبیه سازی از شبیه سازی ژیلسپی (B) یا مدل سازی قطعی (C) در 0. 7 ٪ Arabinose و 2 میلی متر IPTG. Arac Dimers (سبز) ، تترامرهای لاکی (قرمز) و mRNA LACI (سیاه) نشان داده شده است. D-E ، مقایسه مدل سازی و آزمایش برای دوره نوسان در 0. 7 ٪ Arabinose (D) یا 2 میلی متر IPTG (E). مقادیر از مدل سازی قطعی (منحنی آبی) ، شبیه سازی های تصادفی (نمادهای خاکستری ، شکل 18) و میکروسکوپ (الماس قرمز) یا فلوسیتومتری جریان (حلقه های سبز) نشان داده شده است.

دامنه و دوره نوسانات به عنوان تابعی از سطح القا کننده را می توان با استفاده از شکل 4C از نظر مفهومی توضیح داد. پشت سر هم با رونویسی پایه mRNA از هر دو پروموتور شروع می شود و هم فعال کننده و هم سرکوبگر را رمزگذاری می کند. پس از یک تأخیر کوتاه (ناشی از ترجمه ، تاشو پروتئین و چند مدیت سازی) ، میزان فعال کننده عملکردی سریعتر از میزان سرکوبگر عملکردی افزایش می یابد ، همانطور که در شکل 4B نشان داده شده است. این به دو دلیل رخ می دهد. اول ، ژن فعال کننده روی پلاسمید شماره کپی بالاتر از ژن سرکوبگر قرار دارد ، به این معنی که رونوشت های فعال کننده بیشتری نسبت به رونوشت های سرکوبگر تولید می شوند. دوم ، با فرض اینکه رونویسی و ترجمه اشکال مونومر هر دو پروتئین با سرعت مشابه اتفاق می افتد ، فعال کننده فراوان تر خواهد بود زیرا شکل تترامری عملکردی LACI به دو برابر مونومر نیاز دارد و شکل دیمریک عملکردی ARAC. با افزایش سطح ARAC ، یک فعال سازی در تولید mRNA به دلیل حلقه بازخورد مثبت رخ می دهد. پس از تبدیل LACI به تعداد کافی از تترامرها ، تولید mRNA خاموش می شود و پروتئین ها به صورت آنزیمی پوسیده می شوند. هنگامی که تمام پروتئین ها پوسیده شدند ، مروج ها از همه تنظیم کننده های محدود آزاد می شوند و چرخه دوباره شروع می شود. طول دوره در درجه اول با زمان لازم برای پوسیدگی پروتئین ها تعیین می شود. بنابراین ، این دوره به میزان پوسیدگی آنزیمی و بزرگی فعال شدن وابسته است. علاوه بر این ، از آنجا که اندازه پشت سر هم به خصوصیات القایی پروموتر بستگی دارد ، از این رو نتیجه می گیرد که دوره تقریباً متناسب با سطح القایی پروموتر است.

خلاصه روشها

مدار نوسان ساز دو فیدبندی با قرار دادن ARAC ، LACI و YEMGFP تحت کنترل هیبرید P ساخته شد_lac/ara-1پروموتر 14 در سه کاست رونویسی جداگانه. یک برچسب تخریب SSRA 28 برای کاهش طول عمر پروتئین و افزایش وضوح زمانی به هر ژن اضافه شد. این کاست های رونویسی بر روی دو پلاسمید مدولار 14 قرار گرفتند و به یک فشار δ arac Δ laci E. coli تبدیل شدند. مدار نوسان ساز بازخورد منفی با قرار دادن LACI و YEMGFP SSRA تحت کنترل P ساخته شد_llaco-1پروموتور 14 در دو کاست رونویسی جداگانه ، که بر روی دو پلاسمید مدولار گنجانیده شده و در یک سویه Δ LACI قرار گرفته اند. سلولها یا در محیط LB یا حداقل یک محیط با 2 گرم در لیتر رشد کردند. نوسانات با استفاده از Arabinose (0. 1-3 ٪) و IPTG (0-30 میلی متر) القا شد. داده های میکروسکوپی تک سلولی با بارگذاری سلولهای ناشی از PDMS مبتنی بر PDMS جمع آوری شد که سلولها را به یک تک لایه محدود می کرد در حالی که آنها را با مواد مغذی 29 تهیه می کردند ، سپس یک منبع ثابت از متوسط و القا کننده ها و تصویربرداری از فلورسانس GFP را برای هر 2-3 دقیقه برای تهیه می کنند. حداقل 4-6 ساعت. این داده ها بیشتر با استفاده از اسکریپت های MATLAB ImageJ و به صورت سفارشی برای استخراج مسیرهای فلورسانس تک سلولی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. فلوسیتومتری جریان یا با گرفتن نمونه از یک فرهنگ به طور مداوم رشد یافته و رقیق شده یا با رشد چندین فرهنگ به طور موازی برای مدت زمان مختلف انجام شد. در هر صورت ، نمونه ها مستقیماً از محیط رشد آنها خوانده می شدند و سر و صدای کم پراکندگی با آستانه برداشته شد. دوره نوسان فلوسیتومتری جریان به عنوان زمان سپری شده بین قله های فلورسانس اول و دوم تعریف شد. جزئیات مدل های مورد بحث در اطلاعات تکمیلی ارائه شده است. شبیه سازی های تصادفی با استفاده از الگوریتم 27 Gillespie انجام شد و شبیه سازی های قطعی با استفاده از اسکریپت های MATLAB سفارشی انجام شد.

مواد و روش ها

پلاسمید نوسان ساز و ساخت کرنش

اجزای نوسان ساز ARAC و LACI و یک پروتئین گزارشگر فلورسنت (YEMGFP) با برچسب های Tsaandenyalaa SSRA ترمینال کربوکسی 28 برچسب گذاری شدند. YEMGFP حاوی جهش F64L/S65T/A206K است. این ژنهای برچسب زده سپس تحت کنترل رونویسی P به پلاسمیدهای ماژولار PZ کلون شدند_lac/ara-1پروموتور هیبریدی 14 برای تشکیل سه ماژول رونویسی هسته ای با پروموتورهای یکسان ، توالی اتصال ریبوزوم و پایانه های پایین دست. پ_lac/ara-1پروموتور توسط ARAC در حضور Arabinose فعال می شود و در غیاب IPTG توسط LACI سرکوب می شود. ماژول فعال کننده ARAC و ماژول Reporter YEMGFP بر روی پلاسمید Cole1 قرار داده شد و ماژول سرکوبگر روی پلاسمید P15A قرار گرفت. تمام بخش های تقویت شده PCR و اتصالات توالی با توالی تأیید شد.(شکل 1 را ببینید.) یک سویه Δ arac Δ laci با انتقال فاژ P1 PR1 بین سویه های δ ARAC و Δ LACI ساخته شد. دو پلاسمید که در بالا توضیح داده شد ، برای ساخت فشار نوسان ساز دوتایی در این فشار قرار گرفتند.

برای ساخت فشار نوسان ساز بازخورد منفی ، پروموتر هیبریدی p_llaco-114 برای تنظیم بیان LACI و YEMGFP استفاده شد. این مروج در غیاب IPTG توسط لاکی سرکوب می شود. همانطور که در بالا توضیح داده شد ، هر دو ژن با برچسب های SSRA برچسب گذاری شدند. دو ماژول رونویسی حاوی P_llaco-1و LACI یا YEMGFP مانند بالا ساخته شدند. ماژول سرکوبگر روی پلاسمید p15a قرار گرفت و ماژول گزارشگر روی پلاسمید Cole1 قرار گرفت. سپس اینها به یک فشار δ LACI تبدیل شدند.

میکروسکوپ

ما سلولهایی را با میکروسکوپ فلورسانس به موقع تک سلولی با استفاده از دستگاههای میکروسیالی که برای حمایت از رشد یک لایه سلولهای اشرشیاکلی تحت جریان مواد مغذی ثابت طراحی شده اند ، بررسی کردیم (مکمل شکل 2). طراحی دستگاه میکروسیالی مورد استفاده در تمام آزمایشات میکروسکوپی از طراحی میکروشموستات تسلا 29 برای استفاده با ساکارومایسس سرویزیه اقتباس شده است. اصلاحات ایجاد شده برای پشتیبانی از تصویربرداری از تک لایه های E. coli شامل پایین آمدن ارتفاع محفظه سلول برای مطابقت با قطر استوانه ای سلول های K-12 MG1655 ، پایین آمدن ارتفاع کانال تحویل برای حفظ تقسیم جریان معادل بین محفظه سلول و کانال بای پس و تقسیم قسمتمنطقه به دام انداختن سلول به سه کانال برای مشاهده همزمان مستعمرات جدا شده (شکل مکمل شکل 2 A-B). برای آزمایش های القایی روی تراشه ، ما از یک نوع از این دستگاه استفاده کردیم که یک سوئیچ رسانه مرزی لمینار را به طراحی 30 درج کرده و رشد سلول را برای چندین نسل در رسانه های غیر القایی قبل از القاء و تصویربرداری پشتیبانی می کند (شکل 2C-D)واد

در هر آزمایش ، یک دستگاه میکروسیالی به مرحله سوار شد و با استفاده از محلول 0. 1 ٪ Tween 20 سورفاکتانت در محیط رشد مناسب خیس شد. برای رشد بهینه E. coli ، دمای تراشه به طور معمول در دمای 37 درجه سانتیگراد با جریان آب گرم شده از طریق کانال های حرارتی عمیق ساخته شده به دستگاه حفظ می شود. سلولهایی که از یک کشت یک شبه به محیط القاء شده تقریباً 4-4 ساعت منتقل شده بودند ، با هدایت جریان زیاد هم از درگاه سلول و هم درگاه رسانه به درگاه زباله ، از درگاه سلول بارگیری شدند. پس از به دام انداختن یک سلول واحد در هر کانال ، جریان از محفظه سلول معکوس شد و به 1-2 میکرومتر در ثانیه کند شد به گونه ای که مواد مغذی تازه از طریق ترکیبی از انتشار و پیشرفت بدون ایجاد اختلال جسمی سلول ها از درگاه رسانه تحویل داده می شوند.

سلولها برای پر کردن کانال ها در طول مدت آزمایشی 4-6 ساعت ، از نظر لگاریتمی رشد کردند ، در حالی که تصاویر هر 2-3 دقیقه در بزرگنمایی 100 برابر در کانال های منتقل شده و فلورسنت به دست آمد. تمرکز در حین دستیابی به تصویر یا با تنظیم دستی یا الگوریتم های فوکوس خودکار مبتنی بر کنتراست حفظ شد. پس از هر جلسه تصویربرداری ، مسیرهای فلورسانس سلولهای فردی با استفاده از بسته آنالیز سلول WCIF ImageJ استخراج شد. برای هر قاب فلورسانس ، میانگین مقادیر فلورسانس یکپارچه در مناطق دایره ای ثابت حک شده در مرزهای سلولهای ردیابی محاسبه شد. مسیرهای فلورسانس طولانی مدت پس از آن با ردیابی دستی هر سلول در طول آزمایش ساخته شد.

فلوسیتومتری جریان

سلولهای نوسان ساز در ابتدا با فلوسیتومتری جریان کشت دسته ای برای شناسایی شرایط القا کننده که از نوسانات پشتیبانی می کنند ، مشخص می شدند. پس از آن ، فلوسیتومتری جریان Timecourse بلافاصله پس از القاء برای دنبال کردن پویایی نوسان انجام شد. این فلوسیتومتری جریان زمانی یکی از دو پروتکل مشابه را دنبال کرد. در پروتکل مداوم ، یک کشت واحد برای حفظ رشد لگاریتمی رقیق شد. کشت در نقطه زمانی اولیه القا شد و نمونه ها برای فلوسیتومتری جریان در طول آزمایش حذف شدند. در پروتکل کل ، یک فرهنگ نامعلوم در رشد لگاریتمی بر روی غلظت های مختلف القا کننده قرار گرفت ، و این خرده فرهنگها مجاز به رشد برای طول های مختلف قبل از فلوسیتومتری بودند. فلوسیتومتری جریان به طور مستقیم از کشتهای در حال رشد انجام شد و نویز کم پراکندگی غیر سلولی با آستانه برداشته شد. نوسانات با اندازه گیری میانگین فلورسانس سلولی در هر نقطه زمانی ردیابی شد. دامنه نوسان اولیه معمولاً بالاتر از نوسانات بعدی بود ، احتمالاً به دلیل عدم هماهنگ سازی نوسانات (شکل 8). دوره نوسان به عنوان زمان سپری شده بین قله های نوسان اول و دوم تعریف شده است. تمام تجزیه و تحلیل فلوسیتومتری جریان بر روی یک Becton-Dickinson Facscan انجام شد.