تولید سلولهای بنیادی پرتوان ناشی از هیپویمیمونوژنیک توسط سیستم CRISPR-CAS9 و ارزیابی دقیق برای کاربردهای بالینی

مرکز تحقیقات و کاربردهای سلول IPS ، دانشگاه کیوتو ، 53 Shogoin Kawahara-cho ، Sakyo-ku ، Kyoto 606-8507 ، ژاپن الی و Edythe مرکز گسترده پزشکی بازسازی و تحقیقات سلولهای بنیادی ، دانشگاه کالیفرنیا ، سان فرانسیسکو ، 35 مرکز پزشکیراه ، سانفرانسیسکو ، کالیفرنیا 94143 ، ایالات متحده

آکیتسو هوتا وابستگی

مرکز تحقیقات و کاربرد سلول IPS ، دانشگاه کیوتو ، 53 Shogoin Kawahara-cho ، Sakyo-ku ، Kyoto 606-8507 ، ژاپن

نائوکو تاکاسو وابستگی بنیاد CIRA ، 53 Shogoin Kawahara-cho ، Sakyo-ku ، Kyoto 606-8397 ، ژاپن ماسایوشی تسوکاهارا مکاتبات

نویسنده مسئول: Masayoshi Tsukahara ، مرکز تحقیق و توسعه ، بنیاد CIRA ، 53 Shogoin Kawahara-cho ، Sakyo-ku ، Kyoto 606-8397 ، ژاپن.

وابستگی بنیاد CIRA ، 53 Shogoin Kawahara-cho ، Sakyo-ku ، Kyoto 606-8397 ، ژاپن دسترسی آزاد منتشر شده: 28 مه 2022 doi: https://doi. org/10. 1016/j. omtm. 2022. 05. 010

به منظور گسترش نوید داروهای احیا کننده با استفاده از سلولهای بنیادی پرتوان ناشی از آلوژنیک (IPSC) ، ویرایش ژنوم دقیق و کارآمد ژن های آنتی ژن لکوسیت انسانی (HLA) برای به حداقل رساندن رد ایمنی ناشی از عدم تطابق نوع HLA سودمند خواهد بود. با این حال ، ویرایش ژنوم درجه بالینی از ژن های متعدد HLA در خطوط IPSC انسانی ناشناخته است. در اینجا ، ما پروتکل را برای عملکرد خوب تولید (GMP) بهینه کردیم-ویرایش ژنوم CRISPR-CAS9 سازگار برای تخلیه سه مکان ژن (HLA-A ، HLA-B و CIITA) به طور همزمان در IPSC های هموزیگوت HLA. استفاده از IPSC های هموزیگوت HLA یک مزیت اصلی نسبت به IPSC های هتروزیگوت برای القاء حذفی دوگلی توسط یک GRNA واحد دارد. تجزیه و تحلیل فلوسیتومتری RNA و جریان ، کاهش موفقیت آمیز HLA ها را تأیید کرد و تمایز خاص از دودمان به کاردیومیوسیت ها تأیید شد. ما همچنین تأیید کردیم که قدرتمند بودن IPSC های ویرایش شده با ژنوم با موفقیت توسط سه لایه جوانه تمایز حفظ می شود. علاوه بر این ، توالی کل ژنوم ، کاریوتیپ و تجزیه و تحلیل نقشه برداری ژنوم نوری هیچ ناهنجاری ژنومی آشکار شناسایی شده در برخی از کلون ها را نشان نداد ، در حالی که تلفات تعداد کپی غیر منتظره ، جابجایی های کروموزومی و تنظیم مجدد ژنومی در سایر کلونها مشاهده شد. نتایج ما حاکی از اهمیت تحلیل های چند بعدی برای اطمینان از ایمنی و کیفیت سلولهای ویرایش شده ژنوم است. خطوط لوله تولید و ارزیابی ارائه شده در اینجا پایه و اساس ویرایش ژنوم درجه بالینی IPSC خواهد بود.

چکیده گرافیکی

کلید واژه ها

معرفی

از آنجا که اختراع سلولهای بنیادی پرتوان ناشی از انسان (IPSC) در سال 2007 ،

• Takahashi K.
• Tanabe K.
• Ohnuki M.
• Narita M.
• Ichisaka T.
• Tomoda K.
• و همکاران

القاء سلولهای بنیادی پرتوان از فیبروبلاست های انسان در بزرگسالان توسط فاکتورهای تعریف شده. سلول. 2007 ؛131: 861-872 https://doi. org/10. 1016/j. cell. 2007. 11. 019

• یو جی.
• Vodyanik M. A.
• Scuga-otto K.
• Antosiewicz-Bourget J.
• Frane J. L.
• تیان س.
• NIE J.
• Jonsdottir G. A.
• Ruotti V.
• استوارت آر.
• و همکاران

خطوط سلولی بنیادی پرتوان ناشی از سلولهای سوماتیک انسان. علوم پایه. 2007 ؛318: 1917-1920 https://doi. org/10. 1126/science. 1151526

بسیاری از پزشکان و محققان در سراسر جهان کاربرد بالقوه IPSC ها را در پزشکی احیا کننده برای بازگرداندن بافت ها یا اندام های اختلال عملکردی در نظر گرفته اند و با جدیت در جهت تحقق این هدف کار کرده اند. چندین پروژه پیشرو در حال حاضر به مرحله آزمایشات بالینی برای بیماری هایی مانند دژنراسیون ماکولا وابسته به سن ، بیماری پارکینسون و کاردیومیوپاتی گشاد شده ، رسیده است.

• ماندای م.
• Watanabe A.
• Kurimoto Y.
• هیرامی Y.
• Morinaga C.
• Daimon T.
• Fujihara M.
• Akimaru H.
• ساکای ن.
• Shibata Y.
• و همکاران

سلولهای شبکیه مشتق از سلولهای بنیادی ناشی از اتولوگ برای دژنراسیون ماکولا. N. Engl. J. Med. 2017 ؛376: 1038-1046 https://doi. org/10. 1056/nejmoa1608368

• تاکاهاشی جی.

آزمایش بالینی برای بیماری پارکینسون در ایالات متحده چراغ سبز می شود. سلول بنیادی سلولی. 2021 ؛28: 182-183 https://doi. org/10. 1016/j. stem. 2021. 01. 013

• Deinsberger J.
• Reisinger D.
• وبر ب.

روند جهانی در کارآزمایی های بالینی شامل سلولهای بنیادی پرتوان: یک تجزیه و تحلیل سیستماتیک چند داده.

NPJ احیا کننده پزشکی. 2020 ؛5: 15 https://doi. org/10. 1038/S41536-020-00100-4

و آزمایشات بالینی بیشتر برای بسیاری از بیماری های دیگر در حال توسعه است ، درست همانطور که درمان CAR-NK مشتق از سلول IPS برای تومورها سازگار است.

• Boyd N. R.
• Tiedemann M.
• Cartledge K.
• CAO M.
• Evtimov V.
• شو.
• نگوین تی.
• نگوین ن.
• Nisbet I.
• بوید آر.
• Trounson A.

IPSC خارج از قفسه ایمونوتراپی CAR-NK مشتق شده برای تومورهای جامد. سیتوتراپی. 2020 ؛22: S199 https://doi. org/10. 1016/j. jcyt. 2020. 04. 067

• Ueda T.
• Kumagai A.
• Iriguchi S.
• Yasui Y.
• Miyasaka T.
• Nakagoshi K.
• Nakane K.
• Saito K.
• تاکاهاشی م.
• Sasaki A.
• و همکاران

اثربخشی غیر بالینی ، ایمنی و پردازش سلولهای بالینی پایدار از سلولهای بنیادی پراکنده ناشی از آنتی ژن 3 سلولهای ضد گلپیکن-3 آنتی ژن- بیان کننده سلولهای لنفوئید طبیعی/سلولهای لنفوئیدی ذاتی.

علمی سرطان. 2020 ؛111: 1478-1490 https://doi. org/10. 1111/cas. 14374

برای گسترش کاربرد سلول درمانی با واسطه IPSC ، تنظیم پیوند آلوژنیک از نظر هزینه های تولید پایین و آمادگی برای بیماران به عنوان یک محصول درمانی خارج از قفسه ، سودمند است. با این حال ، رد ایمنی ناشی از عدم تطابق آنتی ژن های لکوسیت انسانی (HLA) بین اهدا کننده و گیرنده مانع ایجاد سلول درمانی آلوژنیک است.

• Yamanaka S.

ترمیم و چالش های سلولهای بنیادی مبتنی بر سلول های بنیادی. سلول بنیادی سلولی. 2020 ؛27: 523-531 https://doi. org/10. 1016/j. stem. 2020. 09. 014

برای غلبه بر این مسئله ، سهام IPSC را که از اهدا کنندگان سالم که برای ژن های HLA هموزیگوت هستند ، ایجاد کرده ایم. برای اطمینان از کیفیت و ایمنی سهام IPSC ، ما از معیارهای انتخاب دقیق برای خطوط IPSC ایجاد شده برای کاهش خطر تومور شناسی به دلیل جهش ژنومی استفاده کرده ایم و این سهام IPSC قبلاً در برخی از آزمایشات بالینی فوق الذکر استفاده شده است.

• Umekage M.
• Sato Y.
• Takasu N.

نمای کلی: سهام سلول IPS در CIRA. التهابدوباره2019 ؛39: 17 https://doi. org/10. 1186/S41232-019-0106-0

با این حال ، تخمین زده می شود که بیش از 140 خط IPSC که برای HLA-A ، HLA-B و HLA-DR هموزیگوت هستند برای پوشش 90 ٪ از جمعیت ژاپن مورد نیاز خواهد بود.

• Okita K.
• Matsumura Y.
• Sato Y.
• اوکادا A.
• موریزان A.
• Okamoto S.
• هنگ اچ.
• Nakagawa M.
• Tanabe K.
• Tezuka K.-I.
• و همکاران

یک روش کارآمدتر برای تولید سلولهای IPS بدون ادغام. نات. مواد و روش ها. 2011 ؛8: 409-412 https://doi. org/10. 1038/nmeth. 1591 برای پوشش جمعیت چند قومی ، تعداد خطوط مورد نیاز حتی بیشتر خواهد بود.

• تیلور C. J.
• طاووس اس.
• Chaudhry A. N.
• بردلی J. A.
• بولتون E. M.

تولید یک بانک IPSC برای پیوند بافت HLA بر اساس اهدا کننده شناخته شده و انواع HLA گیرنده شناخته شده.

سلول بنیادی سلولی. 2012 ؛11: 147-152 https://doi. org/10. 1016/j. stem. 2012. 07. 014

بنابراین ، علاوه بر ایجاد خطوط IPSC هموزیگوت HLA ، یک استراتژی جایگزین برای جلوگیری از مسئله رد ایمنی پیش بینی می شود.

پیشرفت اخیر در فن آوری های ویرایش ژنوم ، توانایی ما در ویرایش دنباله ژنومی سلولهای IPS را به صورت اراده متحول کرده است. در حقیقت ، چندین گروه نشان داده اند که ژنهای مربوط به HLA یا HLA (مانند ژن B2M) را می توان حذف یا درج کرد تا ایمنی سلول T یا NK را در برابر سلولهای IPS تعدیل کند.

• Goalusse G. G.
• Hirata R. K.
• Funk S. E.
• Riolobos L.
• Lopes V. S.
• Manske G.
• Prunkard D.
• Colunga A. G.
• Hanafi L.-A.
• Clegg D. O.
• و همکاران

سلولهای بنیادی پرتوان HLA-E- بیان از پاسخ های آلوژنیک و لیز توسط سلولهای NK فرار می کنند. نات. بیوتکنول. 2017 ؛35: 765-772 https://doi. org/10. 1038/nbt. 3860

• Deuse T.
• هو ایکس
• Gravina A.
• وانگ دی.
• Tediashvili G.
• د.
• Thayer W. O.
• Wahl A.
• گارسیا J. V.
• Reichenspuer H.
• و همکاران

مشتقات hypoimmunogenic از سلولهای بنیادی پرتوان القا شده از رد سیستم ایمنی در گیرندگان آلوژنیک کاملاً ایمنی جلوگیری می کنند.

نات. بیوتکنول. 2019 ؛37: 252-258 https://doi. org/10. 1038/S41587-019-0016-3

• هان ایکس.
• وانگ م.
• Duan S.
• Franco P. J.
• Kenty J. H.-R.
• Hedrick P.
• شیا ی.
• آلن A.
• فریرا L. M. R.
• Strominger J. L.
• و همکاران

تولید سلولهای بنیادی پرتوان انسانی Hypoimmunogenic انسان. پروکناتلACADعلمیU. S. A. 2019 ؛116: 10441-10446 https://doi. org/10. 1073/pnas. 1902566116

بر این اساس ، ما اخیراً استراتژی جدیدی را برای کاهش رد ایمنی با استفاده از ویرایش ژنوم CRISPR-CAS9 برای حذف انتخاب ژنهای HLA-A و HLA-B در ضمن حفظ HLA-C و سایر HLA های غیر کلاسیک تهیه کردیم.

• Xu H.
• وانگ ب.
• Ono M.
• Kagita A.
• فوجی K.
• Sasakawa N.
• و همکاران

اختلال هدفمند ژن های HLA از طریق CRISPR-CAS9 IPSC ها را با سازگاری ایمنی پیشرفته ایجاد می کند. سلول بنیادی سلولی. 2019 ؛24: 566-578. e7 https://doi. org/10. 1016/j. stem. 2019. 02. 005

در صورت لزوم ، ژن CIITA (کلاس II ، مجتمع سازگاری عمده ، ترانسفورماتور) نیز می تواند برای سرکوب بیان ژنهای کلاس HLA کلاس II از بین برود. چنین IPSC های ویرایش شده با ژنوم HLA می توانند با حذف HLA-A ، HLA-B و تمام HLA های کلاس II از سلولهای T قاتل و سلول های NK فرار کنند. بنابراین HLA-C حفظ شده با عدم تطابق هاپلوتیپ می تواند یک آنتی ژن برای سلولهای T باشد.

• Blais M. E.
• دونگ تی.
• Rowland-Jones S.

HLA-C به عنوان واسطه ای از قاتل طبیعی و فعال سازی سلول T: تماشاگر یا بازیکن اصلی؟. مصون شناسی2011 ؛133: 1-7 https://doi. org/10. 1111/j. 1365-2567. 2011. 03422. x

Hence, we propose to match the HLA-C haplotype with donors. Due to the lower diversity of the HLA-C haplotypes compared with that of HLA-A or HLA-B genes, we estimated that seven lines of HLA-edited iPSCs would thus cover>95% of the Japanese population, while 12 lines would cover>90 ٪ از جمعیت چند قومی.

• Xu H.
• وانگ ب.
• Ono M.
• Kagita A.
• فوجی K.
• Sasakawa N.
• و همکاران

اختلال هدفمند ژن های HLA از طریق CRISPR-CAS9 IPSC ها را با سازگاری ایمنی پیشرفته ایجاد می کند. سلول بنیادی سلولی. 2019 ؛24: 566-578. e7 https://doi. org/10. 1016/j. stem. 2019. 02. 005

در عین حال ، با این حال ، گزارش شده است که ویرایش ژنوم CRISPR ممکن است جهش ژنومی ناخواسته را در سایت های خارج از هدف القا کند ،

• فو Y.
• Foden J. A.
• Khayter C.
• Maeder M. L.
• ریون دی.
• Joung J. K.
• Sander J. D.

جهش زایی خارج از هدف با فرکانس بالا ناشی از هسته های CRISPR-CAS در سلولهای انسانی. نات. بیوتکنول. 2013 ؛31: 822-826 https://doi. org/10. 1038/nbt. 2623

• Cradick T. J.
• خوب E. J.
• Antico C. J.
• بائو جی.

سیستم های CRISPR/CAS9 که ژنهای β- گلوبین و CCR5 را هدف قرار می دهند ، فعالیت خارج از هدف را دارند. اسیدهای نوکلئیک res. 2013 ؛41: 9584-9592 https://doi. org/10. 1093/nar/gkt714 یا حذف های بزرگ غیر منتظره در سایت های هدف.

• Kosicki M.
• Tomberg K.
• بردلی A.

ترمیم شکستگی های دو رشته ناشی از CRISPR-CAS9 منجر به حذف بزرگ و تنظیم مجدد پیچیده می شود.

نات. بیوتکنول. 2018 ؛36: 765-771 https://doi. org/10. 1038/nbt. 4192

سیستم CRISPR از یک RNA راهنما (gRNA) برای تشخیص مکان هدف استفاده می کند. با این حال، برخی از عدم تطابق را می توان تحمل کرد. از این رو، هنگامی که یک توالی هدف مشابه با یک یا چند پایگاه ناهماهنگ در جای دیگری در ژنوم انسان وجود داشته باشد، چنین مکان هایی خارج از هدف ممکن است شکافته شده و جهش ایجاد شود. همچنین خطر جابجایی کروموزومی زمانی که شکستگی های دو رشته ای به کروموزوم های مختلف وارد می شود وجود دارد.

• Choi P. S.
• میرسون ام.

بازآرایی های ژنومی هدفمند با استفاده از فناوری CRISPR/Cas. ناتاشتراک. 2014; 5 : 3728 https://doi. org/10. 1038/ncomms4728

• قضراوی ح.
• پیگانو ام.
• رنوف بی.
• Renaud J.-B.
• سالمیر آ.
• روئیس بی.
• اوه اس.
• تامکینسون A. E.
• هندریکسون E. A.
• جووانانجلی سی.
• و همکاران

جابجایی های کروموزومی در سلول های انسانی با اتصال انتهایی غیر همولوگ متعارف ایجاد می شود. مول. سلول. 2014; 55 : 829-842 https://doi. org/10. 1016/j. molcel. 2014. 08. 002

اختلال ژن مولتی پلکس برای تولید iPSCهای هیپوایمونوژنیک ضروری است. علاوه بر این، توالی های DNA ژن های HLA بسیار شبیه به یکدیگر هستند، از این رو خطر جهش زایی خارج از هدف یا بازآرایی کروموزومی می تواند بیشتر از هدف قرار دادن مکان ژنی دیگر باشد. خطر مرتبط با ترجمه بالینی ویرایش ژن HLA مالتی پلکس هنوز باید بررسی شود.

برای ترجمه این استراتژی ویرایش HLA برای کاربردهای بالینی ، ما روشهای تولید ویرایش ژنوم CRISPR-CAS9 را در IPSC ها تحت شرایط تولید خوب (GMP) ایجاد کردیم. از آنجا که ژنهای HLA در بین افراد و بین دو آلل بسیار متغیر هستند ، طراحی یک GRNA مناسب از نظر فنی چالش برانگیز است که می تواند هر دو آلل ژن HLA را هدف قرار دهد ، ضمن اینکه از خطر اتصال خارج از هدف جلوگیری می کند. برای این منظور ، ما از خطوط IPSC هموزیگوت HLA که منشأ رده های سلولی با درجه بالینی است که قبلاً ایجاد کرده بودیم استفاده کردیم ، زیرا توالی ژنومی هر دو آلل HLA تقریباً در اهدا کنندگان هموزیگوت HLA یکسان است. از این رو ، یک GRNA واحد برای هدف قرار دادن هر دو آلل کافی است ، و ما می توانیم از استفاده از GRNA های متعدد برای هدف قرار دادن یک ژن HLA واحد خودداری کنیم. برای ویرایش ژنوم CRISPR-CAS9 با درجه بالینی ، ما از 4D-Nucleofector سازگار با GMP برای الکتروپورت کردن مجموعه پروتئین CAS9 فعلی GMP (CGMP) و GRNA های سنتز شده شیمیایی در IPSC های هموزیگوت HLA استفاده کردیم. پس از تأیید راندمان حذفی فله از پروتئین های HLA توسط فلوسیتومتری جریان ، ما زیر مجموعه های جدا شده و آزمایشات یکپارچگی ژنومی دقیق و سنجش عملکردی سلولی ، از جمله تمایز خاص از اصل و نسب را انجام دادیم. ما دریافتیم که ویرایش ژنوم در محل HLA می تواند باعث از بین رفتن تعداد کپی های غیر منتظره ، جابجایی کروموزومی و بازآرایی ژنومی پیچیده در کلونهای متعدد ارزیابی شده توسط توالی ژنوم (WGS) ، کاریوتیپ و تجزیه و تحلیل نقشه برداری ژنوم نوری شود. نتایج ما چالش های هدف قرار دادن مکان ژن HLA با سیستم CRISPR-CAS9 برای برنامه های بالینی آینده را برجسته می کند. بنابراین ، ما می خواهیم اهمیت تست های انتخاب دقیق را بر اساس سنجش های چند بعدی ، از جمله تست های دقیق یکپارچگی ژنومی ، برای ترجمه وعده IPSC های hypoimmunogenic برای برنامه های بالینی آینده پیشنهاد کنیم.

نتایج

تولید IPSC های hypoimmunogenic توسط ویرایش ژنوم CRISPR-CAS9

برای ایجاد پروتکل های عملکرد استاندارد برای تولید IPSC های هیپویمونوژنیک درجه بالینی ، انتخاب خطوط IPSC والدین را شروع کردیم. ما یک خط IPSC به نام FF-I14S04 را انتخاب کردیم ، که قبلاً از سلولهای تک هسته ای خون محیطی تهیه شده توسط یک اهدا کننده (id: qhji) حامل آلل های HLA هموزیگوت (A 24: 02 ، B ∗ 52: 01 ، DR ∗ 15: 02 تولید می شد.) ، که بیشتر در جمعیت ژاپن است.

• Umekage M.
• Sato Y.
• Takasu N.

نمای کلی: سهام سلول IPS در CIRA. التهابدوباره2019 ؛39: 17 https://doi. org/10. 1186/S41232-019-0106-0

از نظر طراحی GRNA ، ما از داده های توالی ژنوم داخلی خود برای این رده سلولی استفاده کردیم تا ویژگی هدف خود یک GRNA داده شده را تأیید کنیم. با توجه به همسانی زیاد بین ژنهای HLA-A و HLA-B ، دریافتیم که ویرایش همزمان ژن های HLA-A و HLA-B با استفاده از یک GRNA منفرد می تواند امکان پذیر باشد (جدول S1). بنابراین ، ما یک GRNA (HLA-A24-EX2G1) را طراحی کردیم که هر دو ژن HLA-A و HLA-B را بر روی کروموزوم 6 هدف قرار می دهد ، و یک GRNA دیگر (CIITA-EX3G5) که ژن Ciita را در کروموزوم 16 هدف قرار می دهد (شکل 1A). پس از بهینه سازی شرایط الکتروپوری ، ما پروتئین CAS9 و دو GRNA (HLA-A24-EX2G1 و CIITA-EX3G5) را به کلون FF-I14S04 با استفاده از 4D-Nucleofector برقی کردیم. راندمان حذفی پروتئین HLA-A و HLA-B در جمعیت سلول فله توسط رنگ آمیزی آنتی بادی HLA-A یا B و فلوسیتومتری جریان (FCM) ، پس از تحریک اینترفرون (IFN) به مدت 2 روز تأیید شد. نتایج نشان داد که 9 /77 ٪ از سلولها برای بیان سطح سلول پروتئین HLA-A منفی بودند و 1 /72 ٪ برای پروتئین HLA-B منفی بودند ، نشان می دهد که حذفی دوگلی به دست آمده است (شکل 1B).

علاوه بر این ، برای بررسی درج یا حذف (Indel) کارایی سایتهای هدف HLA-A ، HLA-B و CIITA در جزئیات بیشتر ، کلون سازی سایت هدف و توالی انجام شد. تقریباً 80 ٪ از سایت های هدف دارای جهش Indel بودند (شکل S1A و جدول S2). این واقعیت که راندمان حذفی دوگلی به دست آمده از FCM ، و القاء ایندل به دست آمده از توالی DNA ژنومی هر یک از سه ژن تقریباً قابل مقایسه بود ، نشان داد که موفقیت یا عدم ویرایش ژنوم در برابر سه مکان توسط دو GRNA در هر سلولهماهنگ و نه مستقل. در مرحله بعد ، ما رقت محدود کننده سلولهای ویرایش شده فله و سلولهای بذر را به چندین صفح 96 چاه با چگالی 0. 25 سلول در چاه انجام دادیم. پس از جداسازی و انبساط کلون های تک سلول مشتق شده تا صفحات 6 چاه ، ما بیان پروتئین HLA-A را با استفاده از فلوسیتومتری جریان هر کلون پس از درمان IFN-γ ارزیابی کردیم. با توجه به یک آزمایش فلوسیتومتری جریان با استفاده از یک آنتی بادی HLA-A پس از کلونینگ ، ما 30 کلون از IPSC های حذفی HLA-A (KO) را از 41 کلون مورد تجزیه و تحلیل (1 /73 ٪) انتخاب کردیم. ما بیشتر این کلون ها را در معرض توالی سانگر ، کاریوتیپ ، WGS ، RNA و بیان پروتئین و ارزیابی پتانسیل تمایز قرار دادیم (شکل 1C). هنگامی که ما برای اولین بار سعی کردیم مناطق HLA-A ، HLA-B و CIITA را از 30 زیر کلون توسط PCR تقویت کنیم ، یا نتوانستیم محصولات PCR را بدست آوریم ، یا محصولات PCR را بدست آوریم که با اندازه محصول پیش بینی شده در 11 کلون تفاوت زیادی داشته باشد (شکلS1b). ما توالی های کیمریک شامل HLA-A و HLA-B در چهار کلون (شکل S1C) پیدا کردیم. این نتایج حاکی از وجود بازآرایی ژنومی جهانی شامل مکان های هدفمند است.

توالی سانگر مناطق HLA-A ، HLA-B و CIITA نشان داد که 19 کلون IPSC در میان 30 کلون فوق دارای جهش های Indel بود ، نه تنها در محل HLA-A بلکه در مکان های HLA-B و CIITA و ششکلون ها حداقل در یکی از مکان های HLA-A یا HLA-B (شکل 1D و S1D) یک جهش درون قاب داشتند. در بین این جهش ها ، تقریبا نیمی از کلون های IPSC دارای 5 جفت پایه (BP) یا در محل HLA بودند ، در حالی که 80 ٪ از کلون ها دارای ایندل های کمتر از 5 جفت باز در محل Ciita بودند (شکل 1E). بنابراین ، اندازه جهش های Indel ممکن است تحت تأثیر توالی GRNA ها یا مناطق هدف قرار گیرد.

• Bae S.
• Kweon J.
• کیم H. S.
• کیم جی.

انتخاب مبتنی بر ریزگردها از سایتهای هدف هسته CAS9. نات. مواد و روش ها. 2014 ؛11: 705-706 https://doi. org/10. 1038/nmeth. 3015

• Van Overbeek M.
• Capurso D.
• کارتر M. M.
• تامپسون M. S.
• فریاس ها
• راس ج.
• و همکاران

پروفایل ترمیم DNA نتایج غیر تصادفی را در استراحت با واسطه CAS9 نشان می دهد. مولسلول. 2016 ؛63: 633-646 https://doi. org/10. 1016/j. molcel. 2016. 06. 037

توالی اسید آمینه پیش بینی شده از کلون های IPSC ویرایش شده ژنوم-به استثنای کلون هایی که دارای جهش های درون قاب هستند-با القاء کدون های توقف زودرس در اگزون های 2 تا 4 کوتاه می شوند (جدول S3).

تجزیه و تحلیل جامع جهش های ژنتیکی ناشی از سیستم CRISPR-CAS9

برای آشکار کردن جهش هایی که در طی ویرایش ژنوم و فرآیند جداسازی کلونال رخ داده است ، ما WGS مبتنی بر خواندن ، کاریوتیپ و نقشه برداری ژنوم نوری را با استفاده از کلون های IPSC با ژنوم ویرایش شده انجام دادیم. اول ، ما توالی های تراز شده به دست آمده از کلون های IPSC ویرایش شده با ژنوم را با IPSC های والدین (نوع وحشی) آنها پس از WGS مقایسه کردیم. تجزیه و تحلیل شماره کپی نشان داد که سه (FF-I14S04 ABII KO #2 ، #6 و #16) از 11 کلون IPSC به طور تصادفی انتخاب شده که در معرض WGS قرار گرفتند ، حذف های بزرگ همزیگوس تقریباً 1. 4 مگابایت بین HLA-A و HLA-B را در خود جای داده اند. LOCI (شکل 2A). علاوه بر این سه کلون IPSC ، ما توالی کیمریک را در سه کلون IPSC (FF-I14S04 ABII KO #8 ، #18 و 22) در محل HLA-A و HLA-B مشخص کردیم ، نشان می دهد که از تنظیم مجدد ژنومی غیر منتظره در ژنومی اتفاق افتاده است. روند ترمیم پس از هضم ژنومی توسط سیستم CRISPR-CAS9. از دیگر جهش های موجود در تجزیه و تحلیل شماره کپی ، جهش واقع در کروموزوم (CHR) 3 در FF-I14S04 ABII KO #2 ممکن است در یک منطقه خارج از هدف CIITA GRNA ممکن باشد ، که با فاصله 1 تعریف شده استKBP در اطراف توالی ها ، امکان 5 جفت باز ناسازگاری و/یا شکاف ها و از جمله ژن RPN1 را که در بین ژنهای شناخته شده مرتبط با سرطان ذکر شده است (در سرشماری کیهانی نسخه 88 ، https://cancer. sanger. ac. uk ذکر شده است./کیهانی/سرشماری ، جدول S4 ، داده های S1 و S2). ما با مقایسه IPSC های ویرایش شده با ژنوم با IPSC های نوع وحشی ، جهش های کوچک ، از جمله انواع تک نوکلئوتیدی (SNV) و Indels های کوچک را بررسی کردیم. SNV های انتخاب شده و Indels به طور بالقوه توالی اسید آمینه را تحت تأثیر قرار داده اند که در هر دو ژن مربوط به سرطان (غیر از ژن HLA-A و CIITA) قرار ندارند یا مناطق خارج از هدف را پیش بینی می کنند (جدول S5).

در مرحله بعد ، نتایج Karyotyping نشان داد که هفت کلون IPSC با ویرایش ژنوم در بین 30 کلون ، جابجایی کروموزومی بین CHR6 (HLA Locus) و Chr16 (مکان CIITA) را نشان داد (شکل 2B و 2C). برای تجزیه و تحلیل دقیق تر ، ما نه کلون IPSC با ویرایش ژنوم ، از جمله IPSC های نوع وحشی (به عنوان کنترل) را در معرض نقشه برداری ژنوم نوری قرار دادیم. نتایج این تجزیه و تحلیل نشان داد که FF-I14S04 ABII KO #8 و #12 جابجایی های کروموزومی بین سایتهای HLA-A یا HLA-B و CIITA (شکل S2) ، که مطابق با نتایج آزمون Karyotyping بود ، ارائه داد ، در حالی که FF-I14S04 ABII KO #15 و #27 جهش های پیچیده ای را شامل می شود که شامل جابجایی جزئی و وارونگی در نزدیکی سایت های شکاف HLA-A و HLA-B است (شکل 2D). همه این تجزیه و تحلیل ژنتیکی جامع نشان داد که بروز مکرر بازآرایی ژنومی غیر منتظره ناشی از ویرایش همزمان ژن سه گانه HLA-A ، HLA-B و CIITA.

ارزیابی پتانسیل تمایز کلونهای IPSC با ویرایش ژنوم < SPAN> در مرحله بعد ، نتایج Karyotyping نشان داد که هفت کلون IPSC با ویرایش ژنوم در بین 30 کلون ، ترانسکتورهای کروموزومی بین CHR6 (HLA Locus) و Chr16 (Locus CIITA) را نشان داد (شکل 2B و شکل 2B و شکل 2B و2C). برای تجزیه و تحلیل دقیق تر ، ما نه کلون IPSC با ویرایش ژنوم ، از جمله IPSC های نوع وحشی (به عنوان کنترل) را در معرض نقشه برداری ژنوم نوری قرار دادیم. نتایج این تجزیه و تحلیل نشان داد که FF-I14S04 ABII KO #8 و #12 جابجایی های کروموزومی بین سایتهای HLA-A یا HLA-B و CIITA (شکل S2) ، که مطابق با نتایج آزمون Karyotyping بود ، ارائه داد ، در حالی که FF-I14S04 ABII KO #15 و #27 جهش های پیچیده ای را شامل می شود که شامل جابجایی جزئی و وارونگی در نزدیکی سایت های شکاف HLA-A و HLA-B است (شکل 2D). همه این تجزیه و تحلیل ژنتیکی جامع نشان داد که بروز مکرر بازآرایی ژنومی غیر منتظره ناشی از ویرایش همزمان ژن سه گانه HLA-A ، HLA-B و CIITA.

Next, to confirm whether genome-edited iPSC clones retained similar differentiation potential to the original iPSC clones, we examined the efficacy of cardiomyocyte differentiation. After the induction of cardiomyocytes though embryo body (EB) formation and a three-stage stepwise differentiation protocol for 15 days, the percentage of troponin T (TnT)-positive cells was measured by FCM (Figures 3A and S3A). The original iPSC clone and eight of the 11 whole-genome-analyzed HLA-edited iPSC clones that were subjected to differentiation assays showed a>ارزیابی پتانسیل تمایز کلون های IPSC با ژنوم ویرایش شده ، نتایج کاریوتایپ نشان داد که هفت کلون IPSC با ویرایش ژنوم در بین 30 کلون ، جابجایی های کروموزومی بین CHR6 (HLA Locus) و Chr16 (CIITA Locus) (شکل 2B و 2C) را نشان داد. برای تجزیه و تحلیل دقیق تر ، ما نه کلون IPSC با ویرایش ژنوم ، از جمله IPSC های نوع وحشی (به عنوان کنترل) را در معرض نقشه برداری ژنوم نوری قرار دادیم. نتایج این تجزیه و تحلیل نشان داد که FF-I14S04 ABII KO #8 و #12 جابجایی های کروموزومی بین سایتهای HLA-A یا HLA-B و CIITA (شکل S2) ، که مطابق با نتایج آزمون Karyotyping بود ، ارائه داد ، در حالی که FF-I14S04 ABII KO #15 و #27 جهش های پیچیده ای را شامل می شود که شامل جابجایی جزئی و وارونگی در نزدیکی سایت های شکاف HLA-A و HLA-B است (شکل 2D). همه این تجزیه و تحلیل ژنتیکی جامع نشان داد که بروز مکرر بازآرایی ژنومی غیر منتظره ناشی از ویرایش همزمان ژن سه گانه HLA-A ، HLA-B و CIITA.

ارزیابی پتانسیل تمایز کلون های IPSC با ویرایش ژنوم

50 ٪ درصد سلول TNT مثبت پس از القاء تمایز ، در حالی که سه کلون دیگر FF-I14S04 ABII KO #2 ، #6 و #16 نسبت سلول TNT مثبت را نشان داد (شکل 3B). همانطور که در شکل 2A نشان داده شده است ، این سه کلون IPSC دارای حذف بزرگ همزیگوس بین محل های HLA-A و HLA-B هستند. بیش از 30 ژن بین مکان HLA-A و HLA-B قرار دارد ، از جمله ژن POU5F1 (به طور متناوب OCT3/4) ، که یکی از مهمترین ژن ها برای حفظ قدرت است. تجزیه و تحلیل بیان این IPSC های ویرایش شده با ژنوم با استفاده از ریزآرایها نشان داد که سطح بیان POU5F1 در FF-I14S04 ABII KO #2 و #6 در مقایسه با موارد موجود در نوع وحشی و سایر IPSC با ژنوم کاهش یافته است. کلون ها (شکل 3C). تفاوت معنی داری در بیان سایر ژنهای نشانگر پرتوان بین کلون ها مشاهده نشد (شکل S3B). اگرچه بیان بسیاری از ژنهای دیگر به میزان بیشتری نسبت به POU5F1 (شکل 3D) تغییر یافته است ، اما محتمل ترین علت از دست دادن پتانسیل تمایز کاردیومیوسیت در این کلون ها احتمالاً حذف منطقه از جمله POU5F1 است. تغییرات در مشخصات رونویسی ، از جمله کاهش بیان POU5F1 ، می تواند تأثیر زیادی بر راندمان تمایز میوکارد داشته باشد. علاوه بر این ، سنجش تمایز سه لایه جوانه با استفاده از کیت تمایز سه گانه STEMDIFF انجام شد. ایمونوسیتوشیمی و FCM بر روی کلونهای IPSC از نوع وحشی ، ویرایش شده با ژنوم (شماره 7 ، 13 ، 24) انجام شد و کسانی که بیان POU5F1 را کاهش می دهند (#2 ، 6 ، 16) برای ارزیابی وضعیت تمایز (شکل S4). تفاوت معنی داری در پتانسیل تمایز به مرحله اولیه سه لایه جوانه در بین کلون های IPSC نوع وحشی و ویرایش شده ژنوم یا کلونهای IPSC با ویرایش ژنوم با و بدون بیان POU5F1 وجود نداشت. تنظیم پایین بیان POU5F1 بر تمایز زودرس تأثیر نمی گذارد ، اما باعث کاهش قابل توجهی پتانسیل تمایز میوکارد شد. بنابراین ، خطوط IPSC ویرایش شده با ژنوم با حذف منطقه بین نسلی HLA-A/HLA-B باید از تجزیه و تحلیل های بیشتر خارج شود.

تجزیه و تحلیل بیان RNA ژنهای کلاس I و کلاس II HLA در کلون های IPSC با ویرایش ژنوم

از آنجا که کلون های IPSC ویرایش شده ژنوم ، جهش های Indel Frameshift را به خود اختصاص داده اند (جدول S3) ، ایمنی بدن آنتی بادی HLA-A به سمت آنها به دلیل تخریب اپی توپ آنتی بادی HLA-A از بین رفت ، در حالی که آنتی بادی ضد HLA-Cهمانطور که در نظر گرفته شده است (شکل 4A) حفظ شد. با توجه به HLA-B ، واکنش آنتی بادی نیز کاهش یافت (شکل 4A). در مرحله بعد ، برای تأیید تأثیر ویرایش ژن HLA-A ، HLA-B و CIITA در بیان ژن HLA ، IPSC های نوع وحشی و ویرایش شده ژنوم به مونوسیت های CD14+ متمایز شدند ، که به بیان هر دو کلاس HLA I و کلاس II شناخته شده اندژن هاپس از تمایز گام به گام ، درصد مونوسیت های CD14+ توسط FCM با استفاده از آنتی بادی ضد CD14 تأیید شد (شکل 4B). سپس ، ما بیان RNA را با توالی RNA (RNA-SEQ) و بیان پروتئین سطح سلول HLA-DR توسط FCM بررسی کردیم. بیان ژن نرمال شده ، که توسط رونوشت ها در هر میلیون مقدار نشان داده شده است ، برای HLA-A ، HLA-B و Classⅱ HLA کاهش یافته است ، اما برای HLA-C ، HLA-E ، HLA-G یا CIITA در CD14+ نیست. مونوسیت های حاصل از کلون های IPSC ویرایش شده ژنوم (شکل S5A و S5B). نقشه های خوانده شده در مناطق ژنهای CIITA نشان داد که جهش های Indel ناشی از ویرایش ژنوم تاثیری در بیان یا نگهداری این رونوشت ها تأثیر نمی گذارد (شکل S5B). CIITA یک فعال کننده رونویسی است که بیان HLA کلاس II را تنظیم می کند. برای بررسی تأثیر CIITA KO ، ما بیان ژنهای HLA کلاس II (HLA-DR ، HLA-DQ ، HLA-DP) را ارزیابی کردیم و در مقایسه با مونوسیت های اصلی CD14+ غیر ویرایش شده بسیار کاهش یافته است (شکل 4C)بشرعلاوه بر این ، ارائه سطح سلول پروتئین HLA-DR در مونوسیت های مشتق از IPSC ژنوم از بین رفت اما در مونوسیت های نوع وحشی نیست (شکل 4D). روی هم رفته ، این نتایج نشان می دهد که عملکرد ژنهای HLA-A ، HLA-B و CIITA در کلون های IPSC ویرایش شده با ژنوم از بین رفت.

بحث

• در این مطالعه ، ما تولید IPSC های hypoimmunogenic و ارزیابی دقیق از کیفیت آنها را نشان دادیم. از آنجا که ما از IPSC ها با ژنهای HLA هموزیگوت استفاده کردیم ، تعداد GRNA های مورد نیاز برای ویرایش ژن برای هدف قرار دادن چندین مکان ، بدون در نظر گرفتن تنوع ژنتیکی در این منطقه می تواند کاهش یابد (شکل 1A). این می تواند نه تنها برای ساده سازی فرایند تولید بلکه برای کاهش جهش های ژنتیکی ناشی از اثرات خارج از هدف GRNA ها سودمند باشد. در میان جهش های کوچک شناسایی شده ، از جمله SNV و ایندل ، که ممکن است توالی اسید آمینه را تحت تأثیر قرار دهد ، IPSC های ویرایش شده با ژنوم که در این مطالعه ایجاد کرده ایم ، جهش هایی را در ژنهای مرتبط با سرطان غیر از ژن های هدف نشان نمی دهد (از جمله HLA-A ،HLA-B و CIITA) یا در همسایه توالی های خارج از هدف را پیش بینی کردند (جدول S5 ؛ داده های S1 و S2). چنین اثرات در مواردی که تعداد بیشتری از GRNA ها استفاده می شود شدیدتر خواهد بود.
• از طرف دیگر ، ما دریافتیم که جهش های پیچیده تر ، مانند حذف های بزرگ در دنباله مداخله بین HLA-A و HLA-B (شکل 2A) و جابجایی های کروموزومی بین محل HLA در CHR6 و CIITA در CHR16 ، اغلب اغلبدر IPSC های ویرایش شده ژنوم (شکل 2B و 2C) رخ داده است. این ممکن است به دلیل ویرایش همزمان ژن سه گانه هدفمند HLA-A ، HLA-B و CIITA باشد. اگرچه رویکردهای ژنوم گام به گام که ژن های فردی را در یک زمان هدف قرار می دهند ممکن است چنین جهش هایی را کاهش دهند ، اما به یک دوره کشت طولانی تر و دورهای مختلف از فرآیندهای فرعی نیاز دارد. علاوه بر این ، معرفی مکرر ژن یا پروتئین GRNA و CAS9 می تواند برای سلول ها استرس زا باشد. چنین کشت طولانی مدت ممکن است به جهش زایی خود به خود منجر شود که می تواند بر خصوصیات سلولی تأثیر بگذارد. از آنجا
• Yoshihara M.

Hayashizaki Y. Murakawa Y.

بی ثباتی ژنومی IPSC ها: چالش هایی در مورد کاربردهای بالینی آنها.

سلولهای بنیادی Rev. Rep. 2017 ؛13: 7-16 https://doi. org/10. 1007/s12015-016-9680-6

• جلوگیری از کشت طولانی مدت برای کاهش خطر مطلوب است. از طرف دیگر ، با رویکرد هدفمند همزمان ، جهش های متمایز را می توان با تجزیه و تحلیل ژنومی متعدد ، از جمله نقشه برداری ژنوم نوری به طور دقیق تشخیص داد (شکل 2D و S2). در نتیجه ، ما می توانیم از استفاده از IPSC هایی که دارای چنین جهش هایی هستند ، خودداری کنیم. از آنجا که هر خط لوله ویرایش ژنوم دارای مزایا و معایب است ، استراتژی ویرایش ژنوم باید برای به حداکثر رساندن ایمنی کاربرد درمانی طراحی شود.
• در مرحله بعد ، ما بررسی کردیم که آیا IPSC های ویرایش شده با ژنوم پتانسیل تمایز کاردیومیوسیت را حفظ کرده اند و دریافتیم که IPSC ها با حذف بزرگ همزیگوس در دنباله مداخله بین HLA-A و HLA-B (FF-I14S04 ABII KO #2 ، #6 و شماره 16) پتانسیل تمایز خود را از دست داد ، در حالی که IPSC های دیگر آن را حفظ کردند (شکل 3A ، 3B و S3A). این به احتمال زیاد به دلیل از بین رفتن همزیگوس آللها ، از جمله ژن POU5F1 ، بین HLA-A و HLA-B (شکل S3B) بود. POU5F1 (در عوض OCT3/4) به خوبی شناخته شده است که یک عامل مهم برای برنامه ریزی مجدد سلولهای سوماتیک است.
• کیم K. P.
• وو Y.
• Yoon J.
• Adachi K.
• وو جی.
• Velychko S.
• MacCarthy C. M.
• شین ب.
• و همکاران

Arauzo-Bravo M. J. و همکاران

صلاحیت برنامه ریزی مجدد فاکتورهای OCT توسط حوزه های انتقال سنج تعیین می شود.

• علمیمشاور2020 ؛6: eaaz7364 https://doi. org/10. 1126/sciadv. aaz7364
• آزمایش های حذفی قبلی که POU5F1 را در سلولهای بنیادی جنینی انسان هدف قرار می دهد (HESC) نشان داد که کاهش بیان POU5F1 منجر به از بین رفتن ظرفیت خودی و اکتشاف خارج از بدن یا خارج از کشور می شود ، اما تمایز مزودرم یا اندودرم نیست.
• وانگ ز.
• oron E.
• نلسون ب.

Razis S. ایوانووا ن.

نقش مشخصات مشخصات Lineage برای NANOG ، OCT4 و SOX2 در سلولهای بنیادی جنینی انسان.

• سلول بنیادی سلولی. 2012 ؛10: 440-454 https://doi. org/10. 1016/j. stem. 2012. 02. 016
• در آزمایش ما ، IPSC ها با از دست دادن همزیگوس آلل ها ، از جمله POU5F1 ، می توانند حداقل 10 قطعه تکثیر خود را حفظ کنند ، و ما نتوانستیم ویژگی های مورفولوژیکی مشخصه این کلون های IPSC را شناسایی کنیم ، حتی اگر بیان POU5F1 در این کلون های IPSCبه نصف کاهش یافته است (شکل S6). اگرچه این IPSC ها پتانسیل تمایز کاردیومیوسیت های خود را از دست داده اند ، ممکن است IPSC ها همانطور که در گزارش قبلی نشان داده شده است ، به سلولهای دیگر مانند سلسله های عصبی متمایز شوند. در حقیقت ، به نظر نمی رسد کاهش بیان POU5F1 تا مرحله اولیه سه لایه جوانه تأثیر بگذارد (شکل S4). اوضاع دقیقاً با IPSC های ما با از دست دادن همزیگوس آلل ، از جمله POU5F1 یا آزمایش های حذفی قبلی در HESC قابل مقایسه نیست زیرا تفاوت بسیار کمی در سطح بیان ژن می تواند منجر به فنوتیپ های مختلف شود.
• Veitia R. A.

Bottani S. Birchler J. A.

اثرات دوز ژن: غیرخطی ، تعامل ژنتیکی و جبران دوز.

• روند ژنرال 2013 ؛29: 385-393 https://doi. org/10. 1016/j. tig. 2013. 04. 004
• بنابراین ، توسعه فن آوری های ویرایش ژنوم برای مدیریت کیفیت محصولات سلولی برای روشهای درمانی احیا کننده ضروری خواهد بود. از آنجا که فن آوری های ویرایش ژنوم به سرعت پیشرفت می کنند ، در حال حاضر می توان آزمایشات دقیقی را نه تنها برای اختلال در یک ژن بلکه برای درج توالی های اهدا کننده طراحی کرد.