قفسه کتاب NCBI. خدمات کتابخانه ملی پزشکی ، انستیتوی ملی بهداشت.

آلبرتز ب ، جانسون A ، لوئیس جی ، و همکاران. زیست شناسی مولکولی سلول. نسخه چهارم. نیویورک: علوم گارلند ؛2002

• با توافق با ناشر ، این کتاب توسط ویژگی جستجو قابل دسترسی است ، اما نمی توان آن را مرور کرد.

زیست شناسی مولکولی سلول. نسخه چهارم.

شروع و تکمیل تکثیر DNA در کروموزوم ها

ما دیده ایم که چگونه مجموعه ای از پروتئین های تکثیر به سرعت و با دقت دو مارپیچ DNA دختر را در پشت یک چنگال تکثیر متحرک ایجاد می کند. اما چگونه این ماشین آلات تکثیر در وهله اول مونتاژ می شود و چگونه چنگال های تکثیر بر روی یک مولکول DNA دو رشته ایجاد می شوند؟در این بخش ، ما در مورد چگونگی آغاز تکثیر DNA و چگونگی تنظیم سلولها با دقت این فرآیند را مورد بحث قرار می دهیم تا اطمینان حاصل شود که در موقعیت های مناسب روی کروموزوم و همچنین در زمان مناسب در زندگی سلول اتفاق می افتد. ما همچنین در مورد چند مورد از مشکلات ویژه ای که ماشین آلات تکثیر در سلولهای اکاریوتیک باید بر آن غلبه کنند ، بحث می کنیم. این موارد شامل نیاز به تکرار مولکولهای DNA بسیار طولانی است که در کروموزوم های اکاریوتیک یافت می شود ، و همچنین دشواری در کپی کردن مولکول های DNA که با هیستون ها در نوکلئوزوم ها کاملاً پیچیده هستند.

سنتز DNA در منشأ تکثیر آغاز می شود

همانطور که قبلاً مورد بحث قرار گرفت ، مارپیچ دوتایی DNA به طور معمول بسیار پایدار است: دو رشته DNA توسط تعداد زیادی از پیوندهای هیدروژن که بین پایه ها در هر رشته تشکیل شده است ، محکم بسته می شوند. برای استفاده به عنوان یک الگوی ، ابتدا مارپیچ دوتایی باید باز شود و دو رشته از هم جدا شوند تا پایه های بدون زوج را در معرض دید خود قرار دهند. همانطور که خواهیم دید ، فرایند تکثیر DNA توسط پروتئین های ویژه ابتکار شروع می شود که به DNA دو رشته متصل می شوند و دو رشته را از هم جدا می کنند و پیوندهای هیدروژن بین پایه ها را می شکند.

موقعیت هایی که برای اولین بار مارپیچ DNA باز می شود ، ریشه های تکثیر نامیده می شوند (شکل 5-29). در سلولهای ساده مانند باکتریها یا مخمرها ، منشاء آن توسط توالی DNA چند صد جفت نوکلئوتید طول مشخص شده است. این DNA حاوی توالی های کوتاه است که پروتئین های آغازگر را به خود جلب می کند ، و همچنین کشش DNA که به ویژه باز است. ما در شکل 4-4 دیدیم که یک جفت پایه A-T توسط کمتر پیوند هیدروژن نسبت به یک جفت پایه G-C در کنار هم قرار می گیرد. بنابراین ، DNA سرشار از جفت های پایه A-T برای جدا شدن نسبتاً آسان است ، و مناطقی از DNA غنی شده در جفت A-T به طور معمول در ریشه های تکثیر یافت می شوند.

شکل 5-29

یک حباب تکراری که با شروع چنگال همانندسازی ایجاد می شود. این نمودار مراحل اصلی درگیر در راه اندازی چنگال های همانند سازی در مبدا تکرار را نشان می دهد. ساختاری که در آخرین مرحله تشکیل شد، که در آن هر دو رشته DNA والدین (بیشتر. )

اگرچه فرآیند اصلی شروع چنگال همانندسازی، که در شکل 5-29 نشان داده شده است، برای باکتری ها و یوکاریوت ها یکسان است، روش دقیق انجام و تنظیم این فرآیند بین این دو گروه از ارگانیسم ها متفاوت است. ابتدا مورد ساده تر و بهتر درک شده در باکتری ها را در نظر می گیریم و سپس به وضعیت پیچیده تر موجود در مخمرها، پستانداران و سایر یوکاریوت ها می پردازیم.

کروموزوم های باکتریایی منشأ واحدی برای همانندسازی DNA دارند

ژنوم E. coli در یک مولکول DNA حلقوی منفرد از 4. 6 × 106 جفت نوکلئوتیدی قرار دارد. همانندسازی DNA از یک مبدا تکثیر آغاز می شود و دو چنگال همانندسازی که در آنجا جمع شده اند (تقریباً 1000-500 نوکلئوتید در ثانیه) در جهت مخالف پیش می روند تا زمانی که تقریباً در نیمه دور کروموزوم به هم برسند (شکل 5-30). تنها نقطه ای که E. coli می تواند همانندسازی DNA را کنترل کند شروع است: هنگامی که چنگال ها در مبدا جمع شدند، با سرعت نسبتاً ثابتی حرکت می کنند تا زمانی که همانندسازی به پایان برسد. بنابراین، جای تعجب نیست که شروع همانندسازی DNA یک فرآیند بسیار تنظیم شده است. زمانی شروع می شود که پروتئین های آغازگر در نسخه های متعدد به مکان های خاصی در مبدا تکثیر متصل می شوند و DNA را در اطراف پروتئین ها می پیچند تا یک کمپلکس پروتئین-DNA بزرگ را تشکیل دهند. سپس این کمپلکس یک DNA هلیکاز را متصل می کند و آن را روی یک تک رشته DNA مجاور می گذارد که بازهای آن توسط مجموعه پروتئین آغازگر-DNA در معرض قرار گرفته است. پریماز DNA به هلیکاز می پیوندد و پریموزوم را تشکیل می دهد که از مبدا دور می شود و یک آغازگر RNA می سازد که اولین زنجیره DNA را شروع می کند (شکل 5-31). این به سرعت منجر به مونتاژ پروتئین های باقی مانده برای ایجاد دو چنگال همانندسازی می شود، با کمپلکس های پروتئینی که در جهت مخالف از مبدا دور می شوند. این ماشین های پروتئینی به سنتز DNA ادامه می دهند تا زمانی که تمام الگوی DNA پایین دست هر چنگال همانندسازی شود.

شکل 5-30

همانندسازی DNA ژنوم باکتری. تقریباً 40 دقیقه طول می کشد تا E. coli ژنوم آن 4. 6 × 106 جفت نوکلئوتیدی را تکثیر کند. برای سادگی، هیچ قطعه اوکازاکی روی رشته عقب مانده نشان داده نمی شود. با نزدیک شدن دو چنگال تکرار چه اتفاقی می افتد (بیشتر. )

شکل 5-31

پروتئین هایی که تکثیر DNA را در باکتری ها آغاز می کنند. مکانیسم نشان داده شده توسط مطالعات آزمایشگاهی با مخلوطی از پروتئین های بسیار خالص شده ایجاد شد. برای تکثیر DNA E. coli، پروتئین آغازگر اصلی پروتئین dnaA است. پریموسوم است (بیشتر. )

در E. coli، برهمکنش پروتئین آغازگر با منشاء همانندسازی به دقت تنظیم می شود، و شروع تنها زمانی رخ می دهد که مواد مغذی کافی برای باکتری در دسترس باشد تا بتواند یک دور کامل از همانندسازی را کامل کند. نه تنها فعالیت پروتئین آغازگر کنترل می شود، بلکه یک منبع تکثیر که به تازگی مورد استفاده قرار گرفته است، «دوره نسوز» را تجربه می کند که ناشی از تأخیر در متیلاسیون نوکلئوتیدهای A تازه سنتز شده است. شروع بیشتر همانندسازی تا زمانی که این As متیله شوند مسدود می شود (شکل 5-32).

شکل 5-32

متیلاسیون منشا تکثیر E. coli یک دوره نسوز برای شروع DNA ایجاد می کند. متیلاسیون DNA در توالی های GATC رخ می دهد، که 11 مورد از آنها در مبدأ همانندسازی یافت می شوند (حدود 250 جفت نوکلئوتید را در بر می گیرند). حدود 10 دقیقه پس از تکرار (بیشتر. )

کروموزوم های یوکاریوتی دارای منشأهای متعددی از همانندسازی هستند

ما دیده ایم که چگونه دو چنگال همانندسازی در یک منشا تکثیر در باکتری ها شروع می شوند و در جهت مخالف پیش می روند و از مبدا دور می شوند تا زمانی که تمام DNA در کروموزوم دایره ای منفرد همانندسازی شود. ژنوم باکتری به اندازه کافی کوچک است که این دو چنگال تکثیر بتوانند ژنوم را در حدود 40 دقیقه تکثیر کنند. به دلیل اندازه بسیار بیشتر اکثر کروموزوم های یوکاریوتی، استراتژی متفاوتی لازم است تا امکان تکثیر به موقع آنها فراهم شود.

روشی برای تعیین الگوی کلی همانندسازی کروموزوم یوکاریوتی در اوایل دهه 1960 توسعه یافت. سلول های انسانی که در کشت رشد می کنند برای مدت کوتاهی با 3H- تیمیدین نشاندار می شوند تا DNA سنتز شده در این دوره به شدت رادیواکتیو شود. سپس سلول ها به آرامی لیز می شوند و DNA روی سطح یک لام شیشه ای پوشیده شده با امولسیون عکاسی رگه ای می شود. توسعه امولسیون الگوی DNA نشاندار شده را از طریق تکنیکی به نام autoradiography نشان می دهد. زمان تخصیص یافته برای برچسب زدن رادیواکتیو به گونه ای انتخاب می شود که به هر چنگال همانندسازی اجازه می دهد چندین میکرومتر در امتداد DNA حرکت کند، به طوری که DNA تکثیر شده را می توان در میکروسکوپ نوری به عنوان خطوطی از دانه های نقره تشخیص داد، حتی اگر مولکول DNA خود آنقدر نازک باشد که نمی توان آن را تشخیص داد. قابل رویت. به این ترتیب می توان هم سرعت و هم جهت حرکت تکرار-چنگال را تعیین کرد (شکل 5-33). با توجه به سرعت افزایش طول مسیرهای DNA تکثیر شده با افزایش زمان برچسب گذاری، چنگال های همانندسازی حدود 50 نوکلئوتید در ثانیه حرکت می کنند. این تقریباً یک دهم سرعت حرکت چنگال های تکثیر باکتریایی است که احتمالاً نشان دهنده افزایش دشواری تکثیر DNA است که در کروماتین بسته بندی شده است.

شکل 5-33

آزمایش هایی که الگوی تشکیل چنگال های تکثیر و حرکت روی کروموزوم های یوکاریوتی را نشان دادند. DNA جدید ساخته شده در سلول های انسانی در کشت به طور خلاصه با پالس تیمیدین بسیار رادیواکتیو (3H-thymidine) برچسب گذاری شد.(الف) در (بیشتر. )

یک کروموزوم انسانی با اندازه متوسط حاوی یک مولکول DNA خطی منفرد از حدود 150 میلیون جفت نوکلئوتیدی است. برای تکثیر چنین مولکول DNA از انتها به انتها با یک چنگال تکثیر که با سرعت 50 نوکلئوتید در ثانیه حرکت می کند، به 0. 02 × 150 × 10 6 = 3. 0 × 10 6 ثانیه (حدود 800 ساعت) نیاز است. بنابراین، همانطور که انتظار می رفت، آزمایش های اتورادیوگرافی که به تازگی توضیح داده شد نشان می دهد که چندین چنگال به طور همزمان روی هر کروموزوم یوکاریوتی حرکت می کنند. علاوه بر این، بسیاری از چنگال ها نزدیک به هم در یک ناحیه DNA یافت می شوند، در حالی که سایر مناطق همان کروموزوم هیچ کدام ندارند.

آزمایش های بیشتر از این نوع موارد زیر را نشان داده است: (1) ریشه های تکثیر تمایل به فعال شدن در خوشه ها ، به نام واحدهای تکثیر ، با شاید 20-80 منشأ دارند.(2) به نظر می رسد واحدهای تکثیر جدید در زمان های مختلف در چرخه سلولی فعال می شوند تا اینکه تمام DNA تکثیر شود ، نکته ای که ما به زیر باز می گردیم.(3) در یک واحد تکثیر ، ریشه های فردی در فواصل 30،000-300،000 جفت نوکلئوتیدی از یکدیگر قرار دارند.(4) همانطور که در باکتریها ، چنگال های تکثیر به صورت جفت تشکیل می شوند و حباب تکثیر ایجاد می کنند زیرا در جهت های مخالف به دور از یک نقطه مشترک حرکت می کنند ، و تنها در هنگام برخورد با چنگال تکثیر در جهت مخالف متوقف می شوند (یا وقتی به پایان کروموزوم برسند). به این ترتیب ، بسیاری از چنگال های تکثیر می توانند به طور مستقل در هر کروموزوم فعالیت کنند و در عین حال دو مارپیچ DNA دختر کامل را تشکیل دهند.

در Eucaryotes تکثیر DNA تنها در یک قسمت از چرخه سلولی صورت می گیرد

هنگام رشد سریع ، باکتری ها به طور مداوم DNA خود را تکرار می کنند و می توانند قبل از اتمام دوره قبلی ، دور جدیدی را شروع کنند. در مقابل ، تکثیر DNA در اکثر سلولهای اوکاریوتی فقط در یک قسمت خاص از چرخه تقسیم سلولی ، به نام فاز سنتز DNA یا مرحله S رخ می دهد (شکل 5-34). در یک سلول پستانداران ، مرحله S به طور معمول حدود 8 ساعت طول می کشد. در سلولهای ساده تر اکاریوتیک مانند مخمرها ، فاز S می تواند به اندازه 40 دقیقه کوتاه باشد. در پایان ، هر کروموزوم برای تولید دو نسخه کامل ، که در سانترومرهای خود به هم پیوسته اند تا مرحله M (M برای میتوز) که به زودی در زیر می آیند ، تکرار شده است. در فصل 17 ، ما سیستم کنترل را که چرخه سلولی را اجرا می کند توضیح می دهیم و توضیح می دهیم که چرا ورود به هر مرحله از چرخه نیاز به سلول دارد تا مرحله قبلی را با موفقیت انجام دهد.

شکل 5-34

چهار مرحله پی در پی از یک چرخه سلولی استاندارد اوکاریوتی. در طول G₁، S ، و G₂مراحل ، سلول به طور مداوم رشد می کند. در طی توقف رشد فاز M ، هسته تقسیم می شود و سلول به دو تقسیم می شود. تکثیر DNA محدود به بخشی از interphase است (بیشتر)

در بخش های بعدی ، ما بررسی می کنیم که چگونه تکثیر کروموزوم در مرحله S چرخه سلولی هماهنگ می شود.

مناطق مختلف در همان کروموزوم در زمان های مشخص در مرحله S تکرار می شوند

در سلولهای پستانداران ، تکثیر DNA در منطقه بین یک منشأ تکثیر و دیگری به طور معمول فقط باید حدود یک ساعت برای تکمیل نیاز داشته باشد ، با توجه به میزان حرکت یک چنگال تکثیر و بیشترین فاصله بین منشأ تکثیر در یک واحد تکثیروادبا این حال ، فاز S معمولاً حدود 8 ساعت در سلول پستانداران طول می کشد. این بدان معنی است که منشأ تکثیر همه به طور همزمان فعال نمی شوند و DNA در هر واحد تکثیر (که همانطور که در بالا ذکر کردیم ، حاوی یک خوشه ای از منشاء تکثیر 20-80 است) تنها در بخش کوچکی از کل S- تکرار می شودفاصله فاز

آیا واحدهای مختلف تکثیر به طور تصادفی فعال می شوند ، یا مناطق مختلف ژنوم به ترتیب مشخص تکرار می شوند؟یکی از راه های پاسخ به این سؤال ، استفاده از تیمیدین آنالوگ برمودوکسیوریدین (BRDU) برای برچسب زدن DNA تازه سنتز شده در جمعیت سلولی هماهنگ است و آن را برای دوره های کوتاه مختلف در طول مرحله S اضافه می کند. بعداً ، در مرحله M ، آن مناطق کروموزومهای میتوزی که BRDU را در DNA خود گنجانیده اند ، می توانند با خاصیت رنگ آمیزی تغییر یافته آنها یا با استفاده از آنتی بادی های ضد BRDU تشخیص داده شوند. نتایج نشان می دهد که مناطق مختلف هر کروموزوم در یک مرحله قابل تکرار در فاز S تکرار می شوند (شکل 5-35). علاوه بر این ، همانطور که انتظار می رود از خوشه های چنگال های تکثیر که در Autoradiographs DNA دیده می شود (شکل 5-33 را ببینید) ، زمان تکثیر در مناطق بزرگ کروموزوم هماهنگ می شود.

شکل 5-35

مناطق مختلف یک کروموزوم در زمان های مختلف در مرحله S تکرار می شوند. این میکروگرافهای سبک کروموزومهای میتوتیک رنگ آمیزی را نشان می دهند که در آن DNA تکرار شونده در فواصل مختلف تعریف شده مختلف از S (بیشتر) برچسب گذاری شده است (بیشتر)

کروماتین بسیار چگالش دیررس را تکرار می کند ، در حالی که ژن های موجود در کروماتین کمتر چگالش تمایل به تکرار زودرس دارند

به نظر می رسد ترتیبی که در آن مبداهای همانندسازی فعال می شوند، تا حدی به ساختار کروماتینی که مبداها در آن قرار دارند بستگی دارد. ما در فصل 4 دیدیم که هتروکروماتین یک حالت غلیظ کروماتین است، در حالی که کروماتین فعال رونویسی دارای ترکیب متراکم کمتری است که ظاهراً برای اجازه دادن به سنتز RNA لازم است. هتروکروماتین تمایل دارد تا در فاز S خیلی دیر تکثیر شود، که نشان می دهد زمان تکثیر به بسته بندی DNA در کروماتین مربوط می شود. این پیشنهاد با بررسی دو کروموزوم X در یک سلول پستانداران ماده پشتیبانی می شود. در حالی که این دو کروموزوم اساساً دارای توالی های DNA یکسانی هستند، یکی برای رونویسی DNA فعال است و دیگری فعال نیست (در فصل 7 بحث شد). تقریباً تمام کروموزوم X غیرفعال به هتروکروماتین متراکم می شود و DNA آن در اواخر فاز S تکثیر می شود. همولوگ فعال آن کمتر متراکم است و در سراسر فاز S تکرار می شود.

این یافته ها نشان می دهند که آن مناطقی از ژنوم که کروماتین آنها کمترین متراکم است، و بنابراین بیشترین دسترسی را برای ماشین های همانندسازی دارند، ابتدا همانندسازی می شوند. اتورادیوگرافی نشان می دهد که چنگال های تکثیر با سرعت های قابل مقایسه ای در سراسر فاز S حرکت می کنند، به طوری که به نظر می رسد میزان تراکم کروموزوم بر زمان شروع چنگال های تکثیر تأثیر می گذارد، نه بر سرعت آنها پس از تشکیل.

رابطه فوق بین ساختار کروماتین و زمان تکثیر DNA نیز توسط مطالعاتی که در آنها زمان تکثیر ژن های خاص اندازه گیری می شود، پشتیبانی می شود. نتایج نشان می دهد که ژن های به اصطلاح «خانه داری» که در همه سلول ها فعال هستند، خیلی زود در فاز S در تمام سلول های آزمایش شده تکثیر می شوند. در مقابل، ژن هایی که فقط در چند نوع سلول فعال هستند، معمولاً در اوایل سلول هایی که ژن ها در آن ها فعال هستند، و بعداً در سایر انواع سلول ها تکثیر می شوند.

رابطه بین ساختار کروماتین و زمان تکثیر مستقیماً در مخمر S. cerevisiae آزمایش شده است. در یک مورد ، منشأی که اواخر مرحله S عمل می کرد ، و در یک منطقه ساکت رونویسی از یک کروموزوم مخمر یافت شد ، به صورت تجربی به یک منطقه فعال رونویسی منتقل شد. پس از جابجایی ، مبدا در اوایل مرحله S عمل می کند ، نشان می دهد که زمان در مرحله S هنگام استفاده از این مبدا توسط محل مبدا در کروموزوم تعیین می شود. با این حال ، مطالعات با منشأ مخمر اضافی وجود منشاء دیگر را نشان می دهد که اواخر تکثیر را شروع می کنند ، حتی در صورت وجود در کروماتین طبیعی. بنابراین ، زمانی که از منشاء استفاده می شود ، می تواند هم با ساختار کروماتین آن و هم با توالی DNA آن تعیین شود.

توالی های DNA به خوبی تعریف شده به عنوان منشاء تکثیر در یک اکاریوت ساده ، مخمر جوانه زنی خدمت می کنند

با دیدن اینکه یک کروموزوم اکاریوتیک با استفاده از منشاء بسیاری از تکثیر تکرار می شود ، که هر یک از آنها در یک زمان مشخص در مرحله S چرخه سلولی "آتش می گیرند" ، ما به ماهیت این ریشه های تکثیر می رویم. ما در اوایل این فصل دیدیم که منشأ تکثیر دقیقاً در باکتریها به عنوان توالی DNA خاص تعریف شده است که به ماشین آلات تکثیر DNA اجازه می دهد تا بر روی مارپیچ DNA دوتایی جمع شوند ، یک حباب تکثیر را تشکیل دهند و در جهت های مخالف حرکت کنند تا چنگال های تکثیر را تولید کنند. به قیاس ، انتظار می رود که منشأ تکثیر در کروموزومهای اکاریوتیک توالی DNA خاص نیز باشد.

جستجوی منشأ تکثیر در کروموزومهای سلولهای اوکاریوتی در مخمر جوانه زنی S. cerevisiae بیشترین تولید را داشته است. روشهای انتخاب قدرتمند برای یافتن آنها ابداع شده است که از سلولهای مخمر جهش یافته برای یک ژن اساسی استفاده می کند. این سلول ها می توانند در یک محیط انتخابی زنده بمانند فقط در صورتی که DNA ارائه شود که دارای یک نسخه عملکردی از ژن مفقود شده باشد. اگر یک پلاسمید باکتریایی دایره ای با این ژن به طور مستقیم به سلولهای مخمر جهش یافته وارد شود ، قادر به تکرار نخواهد بود زیرا فاقد منشأ عملکردی است. اگر قطعات تصادفی از DNA مخمر در این پلاسمید وارد شوند ، با این حال ، فقط چند مولکول DNA پلاسمید که حاوی منشأ تکثیر مخمر هستند می توانند تکرار شوند. سلولهای مخمر که چنین پلاسمیدهایی را حمل می کنند ، قادر به تکثیر هستند زیرا ژن اساسی را به شکلی ارائه می دهند که می تواند تکثیر شود و به سلولهای فرزندان منتقل شود (شکل 5-36). توالی DNA که با حضور آن در پلاسمید جدا شده از این سلولهای مخمر زنده مانده مشخص شده است ، یک توالی تکثیر کننده مستقل (ARS) نامیده می شود. نشان داده شده است که بیشتر ARS ها ریشه های کروموزومی معتبر تکثیر دارند و از این طریق استراتژی مورد استفاده برای به دست آوردن آنها را تأیید می کنند.

شکل 5-36

استراتژی مورد استفاده برای شناسایی ریشه های تکثیر در سلولهای مخمر. هر یک از توالی های DNA مخمر که از این طریق مشخص شده بودند ، یک توالی تکثیر کننده خودمختار (ARS) خوانده می شد ، زیرا پلاسمید را قادر می سازد که حاوی آن باشد تا در سلول میزبان بدون (بیشتر) تکرار شود.

برای جوانه زدن به مخمر ، می توان محل هر منشاء تکثیر در هر کروموزوم را تعیین کرد (شکل 5-37). کروموزوم خاص نشان داده شده - کروموزوم III از مخمر S. cerevisiae - کمتر از 1/100 طول یک کروموزوم انسانی معمولی است. منشأ آن به طور متوسط 30،000 نوکلئوتید از هم فاصله دارد. این تراکم منشاء باید اجازه دهد یک کروموزوم مخمر در حدود 8 دقیقه تکرار شود.

شکل 5-37

منشأ تکثیر DNA در کروموزوم III مخمر S. cerevisiae. این کروموزوم ، یکی از کوچکترین کروموزومهای اکاریوتیک شناخته شده ، در مجموع 180 ژن دارد. همانطور که مشخص شد ، حاوی نه منشأ تکثیر است.

آزمایش های ژنتیکی در S. cerevisiae تأثیر حذف مجموعه های مختلف منشأ تکثیر بر کروموزوم III را آزمایش کرده است. حذف چند ریشه تأثیر کمی ندارد ، زیرا چنگال های تکثیر که از منشأ همسایه تکثیر شروع می شوند ، می توانند به مناطقی که فاقد منشأ خود هستند ادامه یابد. با این حال ، از آنجا که منشأ تکثیر بیشتر از این کروموزوم حذف می شود ، کروموزوم به تدریج از بین می رود و سلول ها تقسیم می شوند ، احتمالاً به دلیل اینکه خیلی آهسته تکرار می شود.

یک مجتمع چند منظوره بزرگ به منشأ اکاریوتیک تکثیر متصل می شود

حداقل توالی DNA مورد نیاز برای هدایت شروع تکثیر DNA در مخمر S. cerevisiae با انجام آزمایش نشان داده شده در شکل 5-36 با قطعات DNA کوچکتر و کوچکتر تعیین شده است. هر یک از منشأ تکثیر مخمر حاوی یک سایت اتصال دهنده برای یک پروتئین آغازگر بزرگ و چند منظوره به نام ORC ، برای مجتمع تشخیص مبدا ، و چندین سایت اتصال کمکی برای پروتئین هایی است که به جذب ORC به DNA مبدا کمک می کنند (شکل 5-38).

شکل 5-38

منشأ تکثیر در مخمر. این منشأ مخمر (که با استفاده از روش نشان داده شده در شکل 5-36 مشخص شده است) دارای یک سایت اتصال دهنده برای ORC است ، مجموعه ای از پروتئین ها که به هر منشاء تکثیر متصل می شود. منشأ به تصویر کشیده شده است (بیشتر)

همانطور که دیدیم ، تکثیر DNA در eucaryotes فقط در مرحله S رخ می دهد. چگونه این تکثیر DNA ایجاد می شود ، و چگونه مکانیسم اطمینان حاصل می کند که از منشأ تکثیر فقط یک بار در هر چرخه سلولی استفاده می شود؟

همانطور که در فصل 17 بحث می کنیم ، اکنون پاسخ های کلی این دو سؤال شناخته شده است. به طور خلاصه ، تعامل ORC-Origin پایداری است که برای نشان دادن منشأ تکثیر در کل چرخه سلولی است. یک مجتمع پروتئینی از پیش استفاده در هر اورک در طول g مونتاژ می شود₁فاز ، حاوی هر دو هلیکاز DNA هگزامری و یک فاکتور بارگذاری هلیکاز (به ترتیب پروتئین های MCM و CDC6). فاز S هنگامی ایجاد می شود که پروتئین کیناز فعال می شود که بقیه ماشین آلات تکثیر را مونتاژ می کند ، به یک هلیکاز MCM اجازه می دهد تا با هر یک از دو چنگال تکثیر که در هر مبدا شکل می گیرد ، حرکت کند. به طور همزمان ، پروتئین کیناز که باعث تحریک فاز S می شود ، مانع از مونتاژ بیشتر پروتئین MCM به مجتمع های پیشگیرانه می شود ، تا اینکه این کیناز در مرحله M بعدی غیرفعال شود تا کل چرخه تنظیم شود (برای جزئیات ، شکل 17-22 را ببینید).

توالی DNA پستانداران که شروع تکثیر را مشخص می کنند دشوار بوده است

در مقایسه با وضعیت موجود در مخمرهای جوانه زده، توالی های DNA که منشأ تکثیر را در سایر یوکاریوت ها مشخص می کنند دشوارتر بوده است. برای مثال، در انسان، توالی های DNA که برای عملکرد منشأ مناسب مورد نیاز هستند، می توانند در فواصل بسیار زیادی در امتداد DNA گسترش یابند.

با این حال، اخیراً امکان شناسایی توالی های DNA انسانی خاص، هر کدام چندین هزار جفت نوکلئوتیدی وجود داشته است که به عنوان مبدا همانندسازی عمل می کنند. این خاستگاه ها زمانی که با روش های DNA نوترکیب به یک ناحیه کروموزومی متفاوت منتقل می شوند، تا زمانی که در ناحیه ای قرار می گیرند که کروماتین نسبتاً متراکم نشده است، به کار خود ادامه می دهند. یکی از این منشاها توالی از خوشه ژن β-گلوبین است. در موقعیت طبیعی خود در ژنوم، عملکرد این منشاء به شدت به توالی های DNA دور بستگی دارد (شکل 5-39). همانطور که در فصل 7 مورد بحث قرار گرفت، این DNA دور به عنوان یک اثر متراکم کننده بر ساختار کروماتین که منشا را احاطه کرده است و شامل ژن β-گلوبین است، شناخته شده است. ظاهراً برای عملکرد این منشا و همچنین برای بیان ژن β-گلوبین، ترکیب کروماتین بازتر حاصل می شود.

شکل 5-39

حذف هایی که منشا تکثیر را در انسان غیرفعال می کند. این دو حذف به طور جداگانه در دو فرد مبتلا به تالاسمی، یک اختلال ناشی از عدم بیان یک یا چند ژن در خوشه ژن β-گلوبین (بیشتر) یافت می شود.

اکنون می دانیم که یک کمپلکس ORC انسانی همولوگ با آن در سلول های مخمر برای شروع همانندسازی مورد نیاز است و پروتئین های Cdc6 و Mcm انسانی نیز نقش اصلی در فرآیند شروع دارند. بنابراین به نظر می رسد که مکانیسم های شروع مخمر و انسان بسیار شبیه به هم باشند. با این حال، به نظر می رسد که مکان های اتصال پروتئین ORC در انسان نسبت به مخمر کمتر اختصاصی است، که ممکن است توضیح دهد که چرا منشاء تکثیر انسان طولانی تر و با وضوح کمتری نسبت به مخمر مشخص است.

نوکلئوزوم های جدید در پشت چنگال همانندسازی مونتاژ می شوند

در این بخش و بخش زیر چندین جنبه اضافی از تکثیر DNA را در نظر می گیریم که مختص eucaryotes هستند. همانطور که در فصل 4 مورد بحث قرار گرفت ، کروموزومهای اکاریوتیک از مخلوط DNA و پروتئین معروف به کروماتین تشکیل شده اند. بنابراین ، کپی برداری کروموزوم نه تنها نیاز به تکثیر DNA دارد بلکه پروتئین های کروموزومی جدید نیز بر روی DNA در پشت هر چنگال تکثیر جمع می شوند. اگرچه ما به تفصیل از درک این فرایند دور نیستیم ، اما ما شروع به یادگیری چگونگی نوکلئوزوم ، واحد اساسی بسته بندی کروماتین می کنیم. مقدار زیادی از پروتئین جدید هیستون ، تقریباً برابر با جرم با DNA تازه سنتز شده ، برای ایجاد هسته جدید در هر چرخه سلولی مورد نیاز است. به همین دلیل ، بیشتر ارگانیسم های اکاریوتیک دارای چندین نسخه از ژن برای هر هیستون هستند. به عنوان مثال ، سلولهای مهره دار حدود 20 مجموعه ژن مکرر دارند که بیشتر مجموعه ها حاوی ژنهایی هستند که هر پنج هیستون را رمزگذاری می کنند (H1 ، H2A ، H2B ، H3 و H4).

بر خلاف اکثر پروتئین ها ، که به طور مداوم در سراسر بین فاز ساخته می شوند ، هیستون ها به طور عمده در مرحله S سنتز می شوند ، هنگامی که سطح mRNA هیستون در حدود پنجاه و پنج برابر افزایش می یابد در نتیجه افزایش رونویسی و کاهش تخریب mRNA. با مکانیسمی که به خصوصیات خاص انتهای 3 آنها بستگی دارد (در فصل 7 مورد بحث قرار می گیرد) ، mRNA های اصلی هیستون بسیار ناپایدار می شوند و در عرض چند دقیقه تخریب می شوند که سنتز DNA در انتهای مرحله S متوقف می شود (یا هنگامی که مهار کننده ها اضافه می شوند متوقف می شوندسنتز DNA زودرس). در مقابل ، پروتئین های هیستون خود به طرز چشمگیری پایدار هستند و ممکن است برای کل زندگی یک سلول زنده بمانند. ارتباط محکم بین سنتز DNA و سنتز هیستون احتمالاً به مکانیسم بازخورد بستگی دارد که سطح هیستون آزاد را کنترل می کند تا اطمینان حاصل شود که میزان هیستون دقیقاً با مقدار DNA جدید سنتز شده مطابقت دارد.

به عنوان یک چنگال تکثیر ، باید به نوعی از هسته های والدین عبور کند. مطالعات آزمایشگاهی نشان می دهد که دستگاه تکثیر از توانایی ذاتی ضعیف در عبور از نوکلئوزومهای والدین بدون جابجایی آنها از DNA برخوردار است. پروتئین های مجدد کروماتین مورد بحث در فصل 4 ، که رابط DNA-هیستون را بی ثبات می کند ، احتمالاً این روند را در سلول تسهیل می کند.

هر دو مارپیچ DNA تازه سنتز شده در پشت یک چنگال تکثیر ، هیستونهای قدیمی را به ارث می برند (شکل 5-40). اما از آنجا که مقدار DNA دو برابر شده است ، برای تکمیل بسته بندی DNA به کروماتین ، مقدار مساوی از هیستون های جدید نیز لازم است. افزودن هیستون های جدید به DNA تازه سنتز شده توسط فاکتورهای مونتاژ کروماتین (CAF) ، که پروتئین هایی هستند که با چنگال های تکثیر مرتبط هستند و DNA تازه سنتز شده را به محض ظهور از ماشین آلات تکثیر مرتبط می کنند. هیستون های H3 و H4 که به تازگی سنتز شده اند به سرعت در دم N- ترمینال خود استیله می شوند (در فصل 4 مورد بحث قرار می گیرد). پس از اینکه در کروماتین قرار گرفتند ، این گروه های استیل به صورت آنزیمی از هیستون ها حذف می شوند (شکل 5-41).

شکل 5-40

تظاهرات که هیستون ها پس از عبور از چنگال تکثیر با DNA همراه هستند. در این آزمایش ، در شرایط آزمایشگاهی انجام شده ، ترکیبی از دو مولکول دایره ای به اندازه متفاوت DNA (که تنها یکی از آنها در نوکلئوزومها جمع می شود) تکرار می شوند (بیشتر).

شکل 5-41

افزودن هیستون های جدید به DNA در پشت یک چنگال تکثیر. نوکلئوزومهای جدید آن رنگهای زرد رنگی در این نمودار هستند. همانطور که مشخص شد ، برخی از هیستونها که در ابتدا آنها را تشکیل می دهند ، به طور خاص زنجیره های جانبی لیزین استیله شده دارند (شکل (بیشتر) را ببینید.

تلومراز انتهای کروموزوم ها را تکرار می کند

ما قبلاً دیدیم که ، از آنجا که DNA پلیمراز DNA DNA را فقط در جهت 5-به 3 ins پلیمریزه می کند ، سنتز رشته تاخیر در یک چنگال تکثیر باید به طور ناپیوسته از طریق مکانیسم پشتی که قطعات DNA کوتاه تولید می کند ، رخ دهد. این مکانیسم هنگامی که چنگال تکثیر به انتهای یک کروموزوم خطی برسد ، با یک مشکل خاص روبرو می شود: جایی برای تولید آغازگر RNA مورد نیاز برای شروع آخرین قطعه اوکازاکی در نوک مولکول DNA خطی وجود ندارد.

باکتریها با داشتن مولکولهای DNA دایره ای به عنوان کروموزوم ، این مشکل "تکرار نهایی" را حل می کنند (شکل 5-30 را ببینید). Eucaryotes آن را به روشی مبتکرانه حل می کند: آنها توالی نوکلئوتیدی ویژه ای در انتهای کروموزوم های خود دارند که در تلومرها گنجانیده شده اند (در فصل 4 مورد بحث قرار می گیرد) ، و آنزیمی به نام تلومراز را جذب می کنند. توالی DNA تلومر در ارگانیسم ها به اندازه تک یاخته ها ، قارچ ها ، گیاهان و پستانداران مشابه است. آنها شامل بسیاری از تکرارهای پشت سر هم از یک دنباله کوتاه هستند که حاوی بلوک نوکلئوتیدهای G همسایه است. در انسان ، این دنباله GGGTTA است و حدود 10،000 نوکلئوتید گسترش می یابد.

تلومراز نوک یک رشته غنی از G از یک توالی تکرار DNA تلومر موجود را تشخیص می دهد و آن را در جهت 5' به 3' دراز می کند. تلومراز یک کپی جدید از تکرار را با استفاده از یک الگوی RNA که جزء خود آنزیم است، سنتز می کند. در غیر این صورت، آنزیم تلومراز شبیه دیگر ترانس کریپتازهای معکوس است، آنزیم هایی که DNA را با استفاده از الگوی RNA سنتز می کنند (شکل 5-42). بنابراین، این آنزیم حاوی تمام اطلاعات مورد استفاده برای حفظ توالی های مشخصه تلومر است. پس از چندین دور گسترش رشته DNA والدین توسط تلومراز، همانندسازی رشته عقب مانده در انتهای کروموزوم را می توان با استفاده از این پسوندها به عنوان الگویی برای سنتز رشته مکمل توسط یک مولکول DNA پلیمراز تکمیل کرد (شکل 5-43).

شکل 5-42

ساختار تلومرازتلومراز یک کمپلکس پروتئین-RNA است که حامل یک الگوی RNA برای سنتز یک توالی DNA تلومر غنی از G مکرر است. فقط بخشی از پروتئین تلومراز همولوگ به ترانس کریپتاز معکوس نشان داده شده است (بیشتر. )

شکل 5-43

همانندسازی تلومر. در اینجا واکنش های درگیر در سنتز توالی های غنی از G مکرر که انتهای کروموزوم ها (تلومر) موجودات یوکاریوتی مختلف را تشکیل می دهند، نشان داده شده اند. انتهای 3' رشته DNA والدین با (بیشتر) گسترش یافته است.

مکانیسمی که به تازگی توضیح داده شد تضمین می کند که انتهای DNA 3 در هر تلومر همیشه کمی طولانی تر از انتهای 5' است که با آن جفت می شود و یک انتهای تک رشته ای بیرون زده باقی می ماند (شکل 5-43 را ببینید). نشان داده شده است که با کمک پروتئین های تخصصی، این انتهای بیرون زده به عقب حلقه می زند تا انتهای تک رشته ای خود را در DNA دوبلکس توالی تکرار تلومری قرار دهد (شکل 5-44). بنابراین، انتهای طبیعی کروموزوم دارای ساختار منحصر به فردی است که آن را از آنزیم های تخریب کننده محافظت می کند و به وضوح آن را از انتهای مولکول های DNA شکسته که سلول به سرعت ترمیم می کند متمایز می کند (شکل 5-53 را ببینید).

شکل 5-44

حلقه های t در انتهای کروموزوم های پستانداران.(الف) میکروگراف الکترونی از DNA در انتهای کروموزوم انسان بین فاز. کروموزوم قبل از مشاهده ثابت، پروتئین زدایی و به طور مصنوعی ضخیم شد. حلقه ای که در اینجا مشاهده می شود تقریباً 15000 است (بیشتر. )

طول تلومر توسط سلول ها و موجودات زنده تنظیم می شود

از آنجایی که فرآیندهایی که هر توالی تلومر را رشد می دهند و کوچک می کنند تقریباً متعادل هستند، یک انتهای کروموزوم حاوی تعداد متغیری از تکرارهای تلومر است. جای تعجب نیست که آزمایش ها نشان می دهند که سلول هایی که به طور نامحدود تکثیر می شوند (مانند سلول های مخمر) مکانیسم های هموستاتیکی دارند که تعداد این تکرارها را در محدوده محدودی حفظ می کنند (شکل 5-45).

شکل 5-45

نشان می دهد که سلول های مخمر طول تلومرهای خود را کنترل می کنند. در این آزمایش، تلومر در یک انتهای یک کروموزوم خاص به طور مصنوعی یا بلندتر (سمت چپ) یا کوتاهتر (راست) از حد متوسط ساخته شده است. پس از چندین تقسیم سلولی، کروموزوم (بیشتر. )

در سلول های سوماتیک انسان، تکرارهای تلومر برای ارائه مکانیسم شمارش به هر سلول پیشنهاد شده است که به جلوگیری از تکثیر نامحدود سلول های سرگردان در بافت های بالغ کمک می کند. بر اساس این ایده، سلول های جسمی ما با یک مکمل کامل از تکرارهای تلومری متولد می شوند. با این حال، آنزیم تلومراز در بافتی مانند پوست خاموش می شود، به طوری که هر بار که یک سلول تقسیم می شود، 50 تا 100 نوکلئوتید از هر یک از تلومرهای خود را از دست می دهد. پس از بسیاری از نسل های سلولی، سلول های نزولی کروموزوم های معیوب را به ارث می برند (زیرا نوک های آن ها نمی توانند به طور کامل تکثیر شوند) و در نتیجه برای همیشه از چرخه سلولی خارج می شوند و تقسیم را متوقف می کنند - فرآیندی که پیری سلولی همانندسازی نامیده می شود (در فصل 17 بحث شد). در تئوری، چنین مکانیزمی می تواند حفاظتی در برابر تکثیر سلولی کنترل نشده سلول های غیرطبیعی در بافت های بدنی ایجاد کند و در نتیجه به محافظت از ما در برابر سرطان کمک کند.

این ایده که طول تلومر به عنوان یک "چوب اندازه گیری" برای شمارش تقسیمات سلولی و در نتیجه تنظیم طول عمر سلول عمل می کند، به روش های مختلفی آزمایش شده است. برای انواع خاصی از سلول های انسانی که در کشت بافت رشد کرده اند، نتایج تجربی چنین نظریه ای را تایید می کند. فیبروبلاست های انسانی به طور معمول برای حدود 60 تقسیم سلولی در کشت قبل از پیری همانندسازی تکثیر می شوند. مانند بسیاری از سلول های سوماتیک دیگر در انسان، فیبروبلاست ها قادر به تولید تلومراز نیستند و تلومرهای آنها هر بار که تقسیم می شوند به تدریج کوتاه می شوند. هنگامی که تلومراز با قرار دادن یک ژن فعال تلومراز در اختیار فیبروبلاست ها قرار می گیرد، طول تلومر حفظ می شود و بسیاری از سلول ها اکنون به طور نامحدود به تکثیر خود ادامه می دهند. بنابراین واضح است که کوتاه شدن تلومر می تواند تقسیمات سلولی را بشمارد و باعث پیری همانندسازی در سلول های انسانی شود.

پیشنهاد شده است که این نوع کنترل در تکثیر سلولی برای حفظ معماری بافت مهم است و همچنین به نوعی مسئولیت پیری حیوانات مانند خودمان را بر عهده دارد. این ایده ها با تولید موش های تراریخته که فاقد تلومراز هستند ، آزمایش شده اند. تلومرها در کروموزوم های موش تقریباً پنج برابر بیشتر از تلومرهای انسانی هستند و بنابراین موش ها باید از طریق سه یا چند نسل قبل از اینکه تلومرها به طول طبیعی انسان کاهش یابد ، پرورش داده شوند. بنابراین شاید تعجب آور نباشد که موش ها در ابتدا به طور عادی رشد می کنند. مهمتر از همه ، موش ها در نسل های بعدی به تدریج نقص بیشتری در برخی از بافت های بسیار تکثیر کننده خود ایجاد می کنند. اما به نظر نمی رسد که این موش ها به طور کلی پیری سن داشته باشند ، و حیوانات مسن تر تمایل به توسعه تومورها دارند. از این جنبه های دیگر ، این موش ها شبیه انسان با بیماری ژنتیکی dyskeratosis pengenita هستند ، که همچنین به کوتاه شدن تلومر زودرس نسبت داده شده است. افراد مبتلا به این بیماری ناهنجاری ها را در ساختارهای مختلف اپیدرمی (از جمله پوست ، ناخن و مجاری اشک) و در تولید گلبول های قرمز نشان می دهند.

از مشاهدات فوق مشخص است که کنترل تکثیر سلولی با حذف تلومرها خطر برای یک ارگانیسم را به همراه دارد ، زیرا همه سلولهایی که فاقد تلومرهای عملکردی در یک بافت نیستند ، از تقسیم متوقف نمی شوند. برخی دیگر ظاهراً از نظر ژنتیکی ناپایدار می شوند ، اما همچنان به تقسیم سلولهای مختلف که می توانند منجر به سرطان شوند ، تقسیم می شوند. بنابراین ، می توان این سؤال را مطرح کرد که آیا عدم وجود تلومراز از اکثر سلولهای سوماتیک انسان یک مزیت تکاملی را فراهم می کند ، همانطور که توسط کسانی که فرض می کنند کوتاه شدن تلومر تمایل دارد ما را از سرطان و سایر بیماریهای تکثیر دهنده محافظت کند ، پیشنهاد می کند.

خلاصه

پروتئین هایی که شروع به تکثیر DNA می کنند به توالی DNA در منشاء تکثیر متصل می شوند تا کاتالیز تشکیل یک حباب تکثیر با دو چنگال تکثیر حرکت به سمت بیرون. این فرآیند از زمانی شروع می شود که یک مجموعه پروتئی ن-DNA آغازگر تشکیل می شود که متعاقباً یک هلیکاز DNA را بر روی الگوی DNA بارگیری می کند. پروتئین های دیگر سپس برای تشکیل "دستگاه تکثیر" مولتیژیم که سنتز DNA را در هر چنگال تکثیر کاتالیز می کند ، اضافه می شوند.

در باکتری ها و برخی از یوکاریوت های ساده، منشأ همانندسازی توسط توالی های DNA خاصی که تنها چند صد جفت نوکلئوتید طول دارند، مشخص می شود. در سایر یوکاریوت ها، مانند انسان، توالی های مورد نیاز برای تعیین منشأ همانندسازی DNA به نظر کمتر تعریف شده اند و منشا می تواند چندین هزار جفت نوکلئوتیدی را در بر بگیرد.

باکتری ها معمولاً منشا تکثیر واحدی در کروموزوم دایره ای دارند. با سرعت چنگال تا 1000 نوکلئوتید در ثانیه، آنها می توانند ژنوم خود را در کمتر از یک ساعت تکثیر کنند. تکثیر DNA یوکاریوتی تنها در یک بخش از چرخه سلولی، فاز S انجام می شود. چنگال تکثیر در یوکاریوت ها حدود 10 برابر آهسته تر از چنگال تکثیر باکتریایی حرکت می کند، و کروموزوم های یوکاریوتی بسیار طولانی تر، هر کدام برای تکمیل همانندسازی خود در یک فاز S معمولی 8 ساعته، به مبداهای تکثیر زیادی نیاز دارند. منشاء تکثیر متفاوت در این کروموزوم های یوکاریوتی در یک توالی فعال می شوند که تا حدی توسط ساختار کروماتین تعیین می شود، با متراکم ترین نواحی کروماتین که همانندسازی خود را در آخر آغاز می کنند. پس از سپری شدن چنگال همانندسازی، ساختار کروماتین با افزودن هیستون های جدید به هیستون های قدیمی که مستقیماً به عنوان نوکلئوزوم توسط هر مولکول DNA دختر به ارث می رسند، دوباره تشکیل می شود.

یوکاریوت ها مشکل تکثیر انتهای کروموزوم های خطی خود را توسط یک ساختار انتهایی تخصصی، تلومر، که به آنزیم خاصی به نام تلومراز نیاز دارد، حل می کنند. تلومراز DNA تلومر را با استفاده از یک الگوی RNA که بخشی جدایی ناپذیر از خود آنزیم است گسترش می دهد و یک توالی DNA بسیار تکراری را تولید می کند که معمولاً برای 10000 جفت نوکلئوتیدی یا بیشتر در هر انتهای کروموزوم گسترش می یابد.